Classicamente, per eseguire un radioimmunoassay, una quantità nota di un antigene viene resa radioattiva, frequentemente etichettandola con isotopi radioattivi gamma di iodio, come 125-I, attaccati alla tirosina. Questo antigene radiomarcato viene quindi miscelato con una quantità nota di anticorpo per quell’antigene e, di conseguenza, i due si legano specificamente l’uno all’altro. Quindi, viene aggiunto un campione di siero di un paziente contenente una quantità sconosciuta di quello stesso antigene. Ciò induce l’antigene senza etichetta (o “freddo”) dal siero a competere con l’antigene radiomarcato (“caldo”) per i siti di legame dell’anticorpo. Quando la concentrazione di antigene “freddo” aumenta, più di esso si lega all’anticorpo, spostando la variante radiomarcata e riducendo il rapporto tra antigene radiomarcato legato agli anticorpi e antigene radiomarcato libero. Gli antigeni legati vengono quindi separati e la radioattività dell’antigene libero(non legato) che rimane nel surnatante viene misurata utilizzando un contatore gamma.
Questo metodo può essere utilizzato per qualsiasi molecola biologica in linea di principio e non è limitato agli antigeni sierici, né è necessario utilizzare il metodo indiretto di misurazione dell’antigene libero invece di misurare direttamente l’antigene catturato. Ad esempio, se è indesiderabile o non è possibile radiolabel l’antigene o la molecola bersaglio di interesse, un RIA può essere fatto se due anticorpi diversi che riconoscono il bersaglio sono disponibili e il bersaglio è abbastanza grande (ad esempio, una proteina) per presentare più epitopi agli anticorpi. Un anticorpo sarebbe radiomarcato come sopra mentre l’altro rimarrebbe non modificato. La RIA inizierebbe con l’anticorpo” freddo ” non etichettato permesso di interagire e legarsi alla molecola bersaglio in soluzione. Preferibilmente, questo anticorpo senza etichetta è immobilizzato in qualche modo, come accoppiato ad un tallone di agarosio, rivestito su una superficie, ecc. Successivamente, l’anticorpo radiomarcato “caldo” può interagire con il primo complesso di molecole bersaglio anticorpo. Dopo un ampio lavaggio, viene misurata la quantità diretta di legame anticorpale radioattivo e quantificata la quantità di molecola bersaglio confrontandola con una quantità di riferimento dosata contemporaneamente. Questo metodo è simile in linea di principio al metodo ELISA a sandwich non radioattivo.