Embryo Project Encyclopedia

Guthrie-testet, även kallat PKU-testet, är ett diagnostiskt verktyg förtesta spädbarn för fenylketonuri några dagar efter födseln. För att administreraguthrie-testet använder läkare Guthrie-kort för att samla kapillärblod från ett spädbarns häl och korten sparas för senare testning. RobertGuthrie uppfann testet 1962 i Buffalo, New York. Fenylketonuri (PKU) är en medfödd födelseavvikelse där toxiska nivåer avaminosyrafenylalanin byggs upp i blodet, en process som påverkarhjärnorna hos obehandlade spädbarn. Guthries test upptäcker fenylalanin iblod av nyfödda, vilket möjliggör tidig diagnos av PKU. Tidigtdiagnoser av PKU förhindrar utveckling av psykiska funktionshinder itusentals individer som drabbas varje år.

PKU är ett arvmetabolisk sjukdom där kroppen inte producerar enzymetfenylalaninhydroxylas. Fenylalanin hydroxylas bryter neraminosyra fenylalanin i blodet. Individer med PKU kan intesmälta höga koncentrationer av aminosyran fenylalanin. Höga koncentrationer av fenylalanin finns i proteinrika livsmedel, såsom kött och fisk, liksom i sötningsmedlet aspartam. Närindivider med PKU misslyckas med att smälta fenylalanin i livsmedel som de konsumerar, höga nivåer av fenylalanin byggs upp i blodet och orsakar hjärnskador. Därför måste individer med PKU äta strängtbegränsade dieter för att undvika att äta mat med höga koncentrationer avfenylalanin. Obehandlad PKU kan leda till psykiska funktionshinder, hjärnskador och kramper. PKU drabbar ungefär en av 15 000 personer i USA årligen.

före skapandet av Guthrie-testet, läkaretestade spädbarn för PKU med ett mindre tillförlitligt järnkloridurin test.Järnkloridurin-testet detekterade närvaron av fenoler,inklusive fenylpyruvat, i urinen. Närvaron av fenolfenylpyruvat i urinen indikerade att individen misslyckades med att smälta fenylalanin eftersom fenylpyruvat är ett derivat av fenylalanin.För att genomföra ett järnkloridurintest löste en läkare en urinprov i en lösning av vatten, etanol och några droppar järnklorid. Om fenylpyruvat var närvarande i provet bildade det enkomplex med järnkloriden och producerade en intensiv blågrönfärg, vilket indikerar att patienten hade PKU. Läkare noterade fleraproblem med järnkloridurin-testet, inkluderade att det misslyckades med attproducera ett positivt testresultat med fenylalaninnivåer under 20milligram per 100 ml. Ett sådant test hade begränsad känslighet ochutövare kunde lätt missa lägre koncentrationer av fenylalaninnivåer hos individer med PKU. Som en konsekvens kämpar läkare för attdiagnostisera och behandla de individer med PKU vars urinprover innehöll låga nivåer av fenylalanin, vilket leder till irreversibla hjärnskador. Många spädbarn testade med järnkloridurin-testet misslyckadesatt testa positivt för PKU under de första sex till åtta veckorna efter födseln.Bevis visade emellertid att fenylalaninnivåerna i blodetöka snabbt under de första dagarna av livet, vilket möjligen leder tillneurologisk skada under den tidsperioden. På grund av felaktigheten i urintestet av järnklorid gick många spädbarn med PKU odiagnostiseradeoch utvecklade symtom som kvarstod under hela livet.

1957 bad läkaren Robert Warner vid Children ’ s Rehabilitation Center inBuffalo,New York, Guthrie att utveckla en mer tillförlitlig och snabb metod för att upptäcka PKU än den som var tillgänglig vid den tiden. Warner visste om Guthries PKU-forskning genom deras gemensamma anslutning till theErie County National Association of Retarded Children i Buffalo. Han bad Guthrie att skapa ett bekvämare sätt att testa för PKU eftersom vidden tiden, för att bekräfta ett positivt järnkloridtest, måste läkare skicka femtio till tjugo kubikcentimeter (cc) venöst blod till en testplats i Kalifornien för att testa varje patient. Laboratorietekniker vid testplatsen utförde sedan ett blodprov för att bekräfta eller bekräfta närvaron av höga nivåer av fenylalanin i blodet. Guthrie utvecklade en nytest för Warner några dagar efter den första begäran. Testet Guthriedeveloped använde en bakteriell inhiberingsanalys för att detektera fenylalanin.

bakteriella inhiberingsanalyser är test där forskare använder bakterieratt mäta koncentrationen av ett ämne i ett prov.2-tienylalanin, en aminosyra, hämmar tillväxten av bakterienbacillus subtilis. Guthrie fann att fenylalanin, en kemikalie som finns iblodet hos personer med PKU, reverserade inhiberingen av B. subtilis tillväxt av B-2-Tienylalanin. Således, för att utföra en PKU-inhiberingsbakteriellanalys, Guthrie belagda en gel som används för att odla bakterier med hjälp av 2-Tienylalanin. Guthrie placerade sedan blodprover, torkade på tjockfilterpapper, på den gelen. Om blodprovet innehållerfenylalanin växte B. subtilis runt blodprovet och indikeradeatt patienten hade PKU. Om blodprovet inte innehållerfenylalanin, B. subtilis växte inte runt blodprovet,vilket indikerar att patienten inte hade PKU. Guthrie noterade att asingeltekniker kunde testa en till 200 blodprover på en enda dagoch att varje test endast krävde en fingerprick av kapillärblod på enfilterpappersskiva.

efter att ha utvecklat testet och visat det för Warner testade Guthrie känsligheten av hans bakteriella inhiberingsanalys med användning avnormala blodprover spikade med fenylalanin. Känslighet ärförmågan hos ett test för att upptäcka alla fall där sjukdomen är närvarande.Guthrie tillsatte 2, 4, 8, 12 och 20 milligram L-fenylalanin per 100milligram blodserum till normala blodprover för att efterlikna nivåerna avfenylalanin som finns hos patienter som drabbats av PKU. Han inkuberade de torkade blodproverna med den tillsatta L-fenylalanin över natten på bakteriella inhiberingsanalyser och fann att bakterier hade vuxit runt pappersskivorna. Han bestämde att bakterietillväxt spikade i proveninnehållande 12 och 20 milligram fenylalanin per 100 milligram avserum, vilket innebär att dessa prover indikerade en individ eventuellt hadPKU och bör genomgå ytterligare blodprovning.

efter att ha utvärderat sitt testi laboratoriet jämförde Guthrie resultaten av sitt test och av järnkloridurin test på 3 118 exemplar från Newark State School inNewark, New York. Sedan bekräftade Guthrie alla positiva fall som bestämtsgenom Guthrie-testet och järnkloridurin-testet med en kvantitativblodanalys. Han jämförde resultaten av Guthrie-testet med resultaten av järnkloridurin-testet och deras känslighet för att detektera sjukdomen noggrant. Guthrie fann att hans test upptäckte tjugoenpositiva fall av PKU som också bekräftades av den kvantitativa blodanalysen, och järnkloridurin-testet upptäckte endast sjutton av dessa fall, vilket innebär att järnkloridurin-testet misslyckades med att upptäcka fyra fall av PKU. Enligt Guthrie föreslog dessa dataatt hans test kunde användas för att upptäcka nya fall av PKU i befolkningarredan screenas med hjälp av järnkloridurin test.

Guthrie förfinade sedan sin metod genom att göra blodinsamlingen bekvämare förläkare. Om läkare diagnostiserade patienter tidigare kunde patienter genomföraen proteinbegränsad diet innan aminosyran fenylalanin steg tilltoxiska nivåer i blodet och orsakade irreversibel neurologisk skada.Efter hans tests första framgång modifierade Guthrie sin bacterialinhibition-analys så att spädbarn kunde testas några dagar efter birth.To gör det, Guthrie bestämde huruvida en liten samling avkapillärt blod från ett spädbarns häl skulle fungera på bakteriellinhibitionsanalysen. Han gjorde kort, senare kallade Guthrie-kort, som vartjocka filterpapper, var och en med ett metallblad som punkterade ett spädbarnshäl och samlade det resulterande blodet. Han lät blodet torka direkt påkortet och sparade det för testning. Från kortet, han hål stansade sedan runt pappersskivan av blodet som skulle placeras senare på agargelkulturen. Guthrie fann att bakteriell inhiberingsanalys fungerade medspädbarns hälblod.

efter Guthries utveckling av sitt PKU-test började National Association of Retarded Citizens i New York City,NewYork, stödja användningen av Guthrie-testet och utvalda tvåsystrar som hade PKU som sina affischbarn för en 1961-ansträngning för att publicera testet. Den äldre systern, Sheila McGrath, hade mentalfunktionshinder och diagnostiserades med PKU senare i livet. Yngresystern, Kammy McGrath, diagnostiserades med PKU av Guthrie-testet och behandlades tidigt i sitt liv och undviker därmed psykiska funktionshinder. Under hösten 1961 publicerade National Association of Retarded Citizensguthrie-testet vid deras presskonferens i San Francisco, Kalifornien,och Life Magazine publicerade en artikel om Guthrie och hans nyfödda skärmföljande år.

även 1961, us Children ’ s Bureau inWashington, D. C., finansierade Guthrie för att testa Guthrie-testet hos 400 000 spädbarn. Guthrie och hans team testade 404 568 spädbarn för PKU med Guthrie-test och järnkloridurin test. Guthrie och hans teamdiagnostiserade trettiosju fall av PKU på två år. Guthries testidentifierade 275 spädbarn som presumptiva positiva för PKU, vilket betyder att de sannolikt skulle ha PKU. Av de 275 spädbarn som antogs positiva för PKU bekräftades trettiosju fall av PKU genom att upprepa Guthrie-testet och använda en kvantitativ blodanalys,vilket innebär att testet var effektivt.

I1962 ingick Guthrie ett kontrakt med Ames Company i Elkhart, Indiana, en division av Miles Laboratories,för att producera och marknadsföra Guthrie testkits till sjukhus. Ames Company föreskrev dock att de bara skulleange ett kontrakt om testet fick ett patent. Guthrie ansökte om apatent på Guthrie-testet i sitt eget namn 1962. Han tecknade sedan ett exklusivt licensavtal med Ames Company. Licensavtalet beviljade Guthrie inga royalties, vilket innebär att Guthrie inte skulle göra några pengar från de sålda testsatserna. Fem procent av nettointäkterna från testet delades mellan National Association for Retarded CitizensResearch Fund, Association for Aid of Crippled Children i New YorkCity, New York och University of Buffalo Foundation i Buffalo, NewYork. Guthrie angav inte vilket pris satserna skulle säljas på ikontraktet.

efter att ha undertecknat kontraktet kämpade Ames Company för attproducera tillräckligt med testsatser för att möta efterfrågan. Guthrie hjälpte till att producera testkits och fick ekonomiskt stöd från US Children ’ s Bureau för att producera och montera kit för att utföra 500 tester i ett hyrt hus inBuffalo, New York. Guthries Kit såldes för $ 6 vardera. 1963, Guthrielärde sig att Ames Company planerade att debitera 262 dollar vardera för samma PKUtest-kit. Enligt biografen Jean Koch krävde Guthrie prisebe sänkt. Guthrie frågade Russell B. Long, en amerikansk Senator från Louisiana, för att undersöka fallet för att se om Ames-företaget hade full legalcontrol över priset på testsatserna.

Senator Long rapporterade att US Public Health Service, en division av US Department of Healthkvarter i Washington, DC, hade inte godkänt Guthries avtal med det privata Ames-företaget. Men två frivilliga hälsoföreningar och Barnsjukhuset i Buffalo hade stött avtalet så Ames-företaget hade full kontroll över priset. Enligt forskaren Diane B. Paul, Guthrie beklagade djupt att inte inkludera aprice-bestämmelse i kontraktet. Ames Company släppte sedan ett uttalande om att inga Kit såldes för $ 262 och att tusentals dollar avprocesser användes för att täcka kostnaderna för byggtillverkningsanläggningar för Guthrie-testsatserna. Företaget sålde testsatser somkunde testa för 325 spädbarn för $ 67,71 vardera.

efter att ha hittat ett företag för att tillverka sina tester kämpade Guthrie för att få sjukhus att genomföra testet och medicinska tidskrifter för att publicera sina försöksresultat. Guthrie ochföräldrar till barn med PKU drev lagstiftare för att bemyndiga nyföddascreening av PKU i varje stat. 1963, Massachusetts uppdrag nyföddascreening för PKU. Året publicerade Guthrie några av hans resultati en peer-reviewed journal. Guthrie kämpade sedan i många stater och länder och höll tal och föreläsningar vid konferenser för att uppmuntra regeringar att mandat Guthrie-testet. Vid 1966 var Guthrie-testetobligatoriskt i de flesta amerikanska stater.

efter 1960-talet betalade forskare meruppmärksamhet på PKU. 1990 samlades forskare runt om i världen tilldiskutera frågor och framsteg inom diagnos och behandling av PKU inParis, Frankrike. Senare samma år genomförde en grupp forskare under ledning av YoshiyukiOkano i Houston, Texas, en mutationsanalys av PAH-genen,som är ansvarig för produktionen av fenylalaninhydroxylas. Den gruppen av forskare skapade också en databas för pahgenmutationer. PAH-databasen ledde till dokumentation av mer än340 genmutationer som kan orsaka PKU. Även på 1990-talet, amerikanska forskaredonald Chase, David Millington, Naoto Terada, Stephen Kahler, Charlesroeoch Lindsay Hofman, utvecklade en ny teknik för att testa för PKU med hjälp avtandem masspektrometri. Forskare använder tandem masspektrometri tillseparera joner baserat på deras laddnings-till-massförhållande för att detektera PKU i blodprover. Tandem masspektrometri, som det ursprungliga Guthrie-testet, använderett hålslag av torkat blod. Det kan dock screena för en bredare variationav medfödda sjukdomar med ett prov.

vid det tjugoförsta århundradet krävde alla femtio amerikanska stater sjukhus för att testa nyfödda för PKU,och Guthrie-testet användes på många ställen över hela världen. Läkare imindre ekonomiskt utvecklade områden använde Guthrie-testet för att diagnostiserapädbarn med PKU. Men i det tjugoförsta århundradet, många sjukhusanvände tandem masspektrometri, som kan screena för en bredare variation avmedfödda sjukdomar än Guthrie-testet. Båda metoderna använder fortfarandeguthrie-kort för att lagra det torkade blodet hos spädbarn för testning.