förvärring av substrattoxicitet med IPTG i Escherichia coli BL21(DE3) som bär en syntetisk metabolisk väg

Biotransformation av TCP genom att vila E. coli BL21(DE3) celler som bär varianter av en syntetisk nedbrytningsväg

varianter av den syntetiska vägen med antingen vildtyp haloalkane DEHALOGENAS eller den 26-faldiga katalytiskt effektivare mutanten dhaa31 infördes i E. coli Bl21(DE3) . Denna värd valdes eftersom varken enzymerna eller metaboliterna i TCP-vägen förekommer naturligt i dess metaboliska nätverk och på grund av den breda repertoaren av kommersiellt tillgängliga Duettvektorer för denna stam, vilket möjliggör avstämbart samuttryck av flera gener i en enda cell . Detta resulterade i konstruktionen av ett flexibelt system med begränsad risk för metabolisk korsprat, där uttrycket av de tre vägkomponenterna kunde manipuleras ortogonalt . Tre tidigare konstruerade E. coli BL21(DE3) nedbrytare betecknade degWT, deg31 och deg31opt testades (Tabell 1). E. coli degWT bär en variant av TCP-vägen baserad på vildtypen DhaA tillsammans med HheC och EchA, uttryckt i ett relativt förhållande av 0,24:0,36:0,40, som bestäms efter förinduktion med 0,2 mM IPTG (ytterligare fil 1: Fig. S1). Stammar deg31 och deg31opt bär båda TCP-vägen med det konstruerade dehalogenas DhaA31, men det relativa förhållandet mellan de tre enzymerna i deg31 är 0,14:0,41:0,45 medan det i deg31opt är 0,63:0,16:0,21. Experiment med natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) indikerade att de tre vägenzymerna tillsammans stod för en liknande andel av den totala lösliga proteinfraktionen som produceras av alla tre nedbrytare: 52% för degWT, 54% för deg31 och 44% för deg31opt.

Pre-inducerad (0.2 mm IPTG) vilande celler av var och en av de rekombinanta stammarna och en värdkontroll (Tabell 1) inkuberades i fosfatbuffert med 2 mM TCP, och tidskurserna för TCP-biotransformation över ett 5 h-intervall registrerades (Fig. 1). Reaktionsprofilerna avslöjade grundläggande skillnader mellan stammarna med avseende på de initiala hastigheterna för TCP-dehalogenering, ackumulering av mellanprodukter och övergripande effektivitet av glycerolbildning. De teoretiska koncentrationerna av glycerol, annars snabbt utnyttjas av E. coli, kunde beräknas från de experimentella koncentrationerna av TCP och detekterade intermediärer på grund av banans ortogonala natur . Medan deg31opt gynnades av det snabbaste första steget (Fig. 1d) var den bästa balanserade vägen med den högsta glycerolproduktionen deg31 (Fig. 1c). Å andra sidan LED degWT av långsam TCP-konvertering (Fig. 1b), långvarig exponering för det toxiska substratet och otillräcklig vägutgång. Som förväntat, värdkontrollen (bär motsvarande tomma plasmider, Fig. 1a) visade ingen aktivitet mot TCP i det slutna batchsystemet.

de tre E. coli-rekombinanter och kontrollstammen som saknar den syntetiska vägen representerar ett lämpligt modellsystem för att studera bidraget från metabolisk börda och substrat/metabolittoxicitet till konditionskostnaden för TCP-biotransformation av helcellskatalysatorer.

bedömning av metabolisk börda och substrattoxicitetseffekter genom plätering

cellviabilitet, uppskattad genom plätering, är en viktig fysiologisk parameter som bör återspegla de enskilda stammarnas förmåga att hantera de påfrestningar som orsakas av metabolisk börda och TCP-exponering . E. coli degraderar förinducerad med 0.2 mM IPTG och värdkontroller pläterades före och efter 5 h inkubation i fosfatbuffert med eller utan 2 mM TCP. Andelen överlevande celler beräknades efter inkubation.

data som erhållits från plätering före inkubation (Fig. 2A) illustrerar de separata effekterna av enskilda delar av den totala metaboliska bördan på cellerna. Flera faktorer, inklusive närvaron av plasmid-DNA och de associerade urvalsmarkörerna, tillsatsen av IPTG och bördan på grund av heterologt väguttryck påverkade nedbrytarnas livskraft parallellt redan före tillsatsen av det toxiska substratet. Den mest uttalade effekten på detta stadium berodde på plasmidunderhåll och det associerade konstitutiva uttrycket av selektionsmarkörgener från Duetvektorerna, liksom närvaron av IPTG. Närvaron av två medelstora till höga kopieringsplasmider pCDF (20-40 kopior per cell) och pETDuet (~40 kopior per cell) minskade livskraften med 50 % (P < 0,01; Fig. 2a). ”Förinduktion” av värdkontrollen med tomma plasmider minskade livskraften med nästan 40% i förhållande till den icke-inducerade kontrollen (P < 0,01). Uttrycket av vägenzymer i E. coli-nedbrytarna minskade ytterligare livskraften med cirka 20% (P < 0, 05). Ytterligare minskning av livskraften hos deg31opt jämfört med degWT och deg31 kan potentiellt tillskrivas skillnaden i antibiotikavalsmarkörer bland tre rekombinanter.

data som samlats in efter 5 h inkubation med eller utan TCP (Fig. 2b och ytterligare fil 1: Fig. S2) inkluderade flera oväntade observationer. Överraskande hade TCP (ursprungligen tillsatt i en koncentration av 2 mM) endast mindre eller försumbara effekter på livskraften hos icke-inducerade kontrollceller som bär tomma plasmider; det fanns ingen signifikant skillnad i livskraft mellan dessa celler och värdkontrollerna som exponerades för varken TCP eller IPTG. Detta var oväntat eftersom TCP har rapporterats starkt hämma växande celler av E. coli BL21 (DE3) och naturliga värdar såsom A. radiobacter AD1 eller Pseudomonas putida MC4 även vid koncentrationer 50% lägre än de som används här . Å andra sidan var den skadliga effekten av IPTG statistiskt signifikant (P < 0, 01) (Fig. 2b och ytterligare fil 1: Fig. S2). Den mest slående observationen var att den relativa livskraften hos celler som förinducerades med IPTG och sedan exponerades för TCP var nästan 90% lägre än för värdkontroller som inte exponerades för något ämne (P < 0.01) (Fig. 2b). Denna dramatiska förlust av livskraft motsvarar inte en enkel summa av de två föreningarnas individuella effekter; det är uppenbart att IPTG förvärrade toxiciteten hos TCP. Det faktum att IPTG förvärrade toxiciteten hos TCP och inte vice versa bekräftades genom plätering av tre rekombinanter som bär den syntetiska biologiska nedbrytningsvägen (Fig. 2b). Eftersom dessa nedbrytare hade funktionella vägar för TCP-nedbrytning kunde de bättre tolerera dess närvaro. Det är viktigt att ju snabbare omvandlingen av TCP av banenzymerna, desto större är nedbrytarnas livskraft. Deg31opt, som uppnådde en snabb initial omvandling av TCP men ackumulerade signifikanta mängder av mellanprodukterna DCP och GDL, överlevde 5 h-inkubationen nästan lika bra som värdkontrollen som inte exponerades för substratet. Dessa data överensstämmer med de tidigare rapporterade resultaten av tillväxtstoppstest, vilket indikerade att TCP är den mest toxiska föreningen i vägen .

bedömning av metabolisk belastning och substrattoxicitetseffekter med multiparameterflödescytometri

multiparameterflödescytometri möjliggör samtidig bestämning av flera biokemiska och fysiska variabler omedelbart efter provberedning och bör därför ge mer exakt information om cellernas fysiologiska status än vad som kan erhållas genom plätering . Denna teknik erbjuder också viktig information om heterogeniteten hos bakteriepopulationer. Till skillnad från plätering underskattar det inte antalet livskraftiga celler i ursprungliga kulturer i fall då en bråkdel av befolkningen har upplevt subletal skada och förlorat förmågan att växa .

inkubation av de tre nedbrytarna och värdkontrollerna utfördes under de förhållanden som nämns i föregående avsnitt. Proverna som drogs tillbaka efter 5 h inkubation med eller utan TCP färgades med propidiumjodid (PI), 6-karboxi-2′,7′-diklordihydrofluoresceindiacetat (karboxi-H2DCFDA) eller bis-(1,3-dibutylbarbitursyra) trimetinoxonol . Färgämnen för märkning av nukleinsyror, såsom PI, som bara kommer in i celler med komprometterade membran, används vanligtvis med membranpotentialkänsliga färgämnen såsom DiBAC4(3), som binder de lipidinnehållande intracellulära komponenterna, för att studera bakteriell livskraft . Karboxi-H2DCFDA är en kemiskt reducerad, acetylerad och karboxylerad form av fluorescein som har funnit många tillämpningar som en allmän indikator för närvaron av reaktiva syrearter (ROS) i eukaryota och prokaryota celler . Nya studier om bakteriell användning av klorerade alifatiska kolväten tyder på att denna process är förknippad med stark oxidativ stress och vi antog att TCP också skulle framkalla ett sådant fysiologiskt svar . Mättnaden av omättade fettsyror genom halogenering eller lipidperoxidation orsakar förändringar i membranfluiditet, vilket resulterar i kollaps av elektrontransportkedjor och för tidig elektronöverföring till syre, åtföljd av ROS-bildning, membranpermeabilisering och celldöd .

slutpunktsflödescytometriprotokollet som antogs i vår studie var mindre känsligt än plätering för att demonstrera bördan orsakad av plasmider (Fig. 2b), möjligen eftersom närvaron av heterologt DNA och det konstitutiva uttrycket av urvalsmarkörer inte direkt förändrade egenskaper riktade av cytometri utan i stället obalanserade cellernas totala energistatus. Flödescytometrimetoden med användning av utvalda fluorokromer var emellertid användbar vid exponering av de toxiska effekterna av IPTG och TCP. Det fanns inga signifikanta skillnader (P > 0.05) mellan de icke-inducerade värdkontrollerna med tomma plasmider, oavsett deras TCP-exponeringsstatus, med avseende på någon av de tre variablerna som undersöktes i dessa experiment (membranpermeabilitet, ROS-bildning och membranpotential; se Fig. 2b). Andelen celler som färgades positivt för DiBAC4 (3) ökade dock upp till tre gånger i kontrollen behandlad med IPTG ensam (P < 0,01). Samma effekt observerades också i deg31, vars svar på induktion och inkubation med TCP studerades mer detaljerat (Fig. 3). Fraktionen av bakteriepopulationen som färgades positivt med alla tre färgämnena ökade många gånger när förbehandling med IPTG kombinerades med TCP-exponering, vilket bekräftar den tidigare observerade förvärrande effekten och indikerar att verkan av TCP i bakterieceller åtföljs av omfattande ROS-bildning (Fig. 2b, 3). Membrandepolarisering, ROS-ackumulering och membranpermeabilitet reducerades i E. coli-rekombinanter som uttryckte den syntetiska biologiska nedbrytningsvägen, varvid reduktionsgraden var proportionell mot stammarnas initiala TCP-omvandlingshastigheter. Intressant nog bekräftades förvärringen av föreningstoxicitet genom preinduktion av BL21(DE3) värdkontroll med IPTG också i experiment med användning av modellen toxisk förening tert-butylhydroperoxid (TBHP), en organisk peroxid och stark ROS-bildning som främjar oxidativt medel (ytterligare fil 1: Fig. S3). Detta tyder på att beskrivet förvärringsfenomen inte bör begränsas endast till vår modell toxic chemical TCP.

Membrandepolarisering och ROS-bildning in vivo är dynamiska processer. För att följa deras kinetik i E. coli-nedbrytare utförde vi också tidsupplösta mätningar (ytterligare fil 1: Fig. S4). Antalet celler färgade av DiBAC4 (3) och karboxi-H2DCFDA ökade linjärt över tiden i alla stressade rekombinanter utom för deg31. Intressant visade denna nedbrytare en initial explosion av DiBAC4 (3) och karboxi-H2DCFDA fluorescens men dessa signaler platåde eller föll något. Vi antar att de karakteristiska profilerna för DiBAC4 (3) och karboxi-H2DCFDA fluorescens för deg31 är kopplade till dess unika variant av den syntetiska biologiska nedbrytningsvägen och motsvarande tidsförlopp för TCP-biotransformation. Till skillnad från de andra stammarna var TCP, 2,3-dikloropropan-1-ol (DCP) och glycidol (GDL) närvarande vid relativt höga koncentrationer i deg31-reaktionsblandningen mellan minuter 50 och 100 av mätperioden. Detta kan ha orsakat synergistisk toxicitet, vilket ökar antalet celler med depolariserade membran och förbättrad ROS-bildning. Sådana gemensamma effekter är vanliga; de har observerats för organofosfatpesticider, fluorosurfactants och tungmetaller, bland andra . Efterföljande frysning eller måttligt fall i signalernas intensitet tillskrevs parallell avlägsnande av TCP och GDL och produktion av glycerol, vilket är känt för att vara ett effektivt spänningsskyddsmedel i jäst-och lösningsmedelstoleranta stammar av E. coli .

varianten av den syntetiska vägen som finns i deg31 verkade ge den bästa kompromissen när det gäller att hantera toxicitet samtidigt som TCP effektivt omvandlades till ofarlig glycerol och valdes därför för vidare undersökning.

bedömning av metabolisk börda och substrattoxicitetseffekter genom elektronmikroskopi

metabolisk börda och toxicitet kan orsaka förändringar i morfologin hos bakterievärdar . Vi använde därför transmissionselektronmikroskopi för att studera förändringar i morfologi av inducerade och icke-inducerade deg31 celler efter 5 h inkubation med eller utan 2 mM TCP (Fig. 3). Bilder av inducerade och icke-inducerade E. coli-värdkontrollceller med tomma plasmider visas i (ytterligare fil 1: Fig. S5). Mikroskopiska observationer följdes av multiparameterflödescytometri av deg31-celler färgade med PI, karboxi-H2DCFDA eller DiBAC4(3).

inkubation av icke-inducerade nedbrytare med TCP producerade endast en liten andel döda bakterieceller, och morfologin hos celler som behandlades på detta sätt skilde sig i allmänhet inte från den hos celler som oexponerades till det toxiska substratet (Fig. 3a, b). Andelen celler färgade av karboxi-H2DCFDA och PI ökade måttligt, men ingen effekt på membranpotentialen observerades. Förinducerade bakterier som producerar rekombinanta proteiner bildade intensivt synliga inklusionskroppar och visade frekvent separation av det cytoplasmatiska membranet från det yttre membranet vid cellens poler (Fig. 3c). Eftersom majoriteten av de rekombinanta proteinerna erhållna från celllysater var lösliga (data visas inte) tror vi att de observerade kropparna bestod av aktiva enzymer.

kombinationen av preinduktion och inkubation med TCP producerade de mest uttalade morfologiska förändringarna och åtföljdes av betydande ökningar av antalet celler som färgades positivt för PI, karboxi-H2DCFDA och DiBAC4(3) (Fig. 3d). Många döda eller döende celler med skadade cytoplasmatiska membran och läckt innehåll var tydligt synliga. Trots detta motstod en betydande del av befolkningen de kombinerade effekterna av IPTG och TCP under 5 h-behandlingsperioden. Detta berodde främst på den välbalanserade syntetiska vägen för deg31 och dess snabba omvandling av TCP till glycerol. Bistabilitet är ett vanligt fenomen och kan hänföras till buller i uttrycket av de multigena egenskaperna som är ansvariga för toxicitetstolerans och det graderade stressresponsen i bakteriepopulationen . Sammanfattningsvis var våra mikroskopiska observationer av deg31-populationer behandlade under fyra olika förhållanden förenliga med tidigare resultat och stödde slutsatsen att preinduktion med IPTG förvärrar TCP-toxicitet.

Toxicitetsexacerbationseffekten stiger i celler som upplever metabolisk börda från plasmider

med tanke på att både E. coli-nedbrytarna och värdkontrollerna som användes i detta arbete var tvungna att klara den metaboliska bördan av Duet-plasmiderna och LacIQ/P lacUV5-T7-expressionssystemet, bestämde vi oss för att inkludera E. coli-kontroller utan dessa komponenter i följande experiment. För detta ändamål använde vi E. coli BL21 (DE3) utan plasmider och kloningsstammen E. coli DH5a, som saknar både LacIQ/P lacUV5-T7-expressionssystemet och lac operon. Genom att använda pläterings-och flödescytometriprotokollen som beskrivits ovan fann vi att förvärringseffekten var blygsam eller helt frånvarande i båda stammarna (ytterligare fil 1: Fig. S6A, B). Detta antyder att dubbelspänningen från IPTG och TCP endast manifesteras i stammar som bär Duetplasmider och motsvarande uttryckssystem.

vi antar att de studerade rekombinanterna inte effektivt kunde undertrycka den dubbla spänningen från IPTG och det toxiska substratet på grund av den metaboliska bördan som plasmider ålägger och motsvarande brist på resurser som krävs för cellunderhåll. Det verkar som att IPTGS kemiska struktur, dess transport eller närvaro inuti cellen utlöser fysiologiska förändringar som underlättar manifestationen av TCP-toxicitet i E. coli BL21(DE3) – celler med Duetplasmider.

minska metabolisk börda och toxicitetsförstöring genom att ställa in IPTG-koncentrationen

därefter försökte vi minska belastningen på E. coli-rekombinanter genom att optimera koncentrationen av IPTG. Vi letade efter den lägsta möjliga koncentrationen av inducerare som skulle minimera träningskostnaden utan att väsentligt äventyra systemets effektivitet vid nedbrytande TCP. Deg31-celler inducerades i förväg med IPTG-koncentrationer från 0,01 till 1,00 mM och de resulterande effekterna på cellviabilitet och vägeffektivitet studerades (Fig. 4; Ytterligare fil 1: Fig. S7).

E. coli BL21 (DE3) med de tomma pETDuet-och pCDF-plasmiderna användes som en kontroll för plätering för att bedöma belastningen på värden genom IPTG-exponering i frånvaro av den heterologa vägen (Fig. 4). Livskraften hos den förinducerade nedbrytaren och kontrollen kontrollerades före och efter 5 h inkubation i fosfatbuffert med 2 mM TCP och jämfördes med den hos celler som inte exponerades för IPTG (Fig. 4a, b). Procentandelen överlevande celler efter inkubation beräknades i varje fall (Fig. 4c). Dessa experiment indikerade att även i frånvaro av TCP fanns en invers korrelation mellan IPTG-koncentrationen och livskraften hos den rekombinanta E. coli (Fig. 4a). Deg31-stammen LED mer av ökande IPTG-koncentrationer än kontrollen, troligen på grund av den extra bördan att uttrycka gener som kodar för den syntetiska vägen. Det motsatta var sant efter 5 h inkubation eftersom TCP-kataboliserande deg31-stammen var mer resistent mot förvärrad toxicitet än värdkontrollen (Fig. 4b, c). Den syntetiska vägstammen uppvisade liknande överlevnadsnivåer vid alla testade IPTG-koncentrationer förutom den högsta-den relativa livskraften hos deg31 förinducerad med 1 mM IPTG var 100 %. Vi antog att detta avlägsna värde berodde på underskattning av antalet livskraftiga celler före inkubation på grund av den intensiva stress som nedbrytaren upplevde vid induktion med en så hög koncentration av IPTG och den resulterande närvaron av livskraftiga men inte odlade celler i suspensionen . Pläteringsexperiment visade att en bråkdel av bakteriepopulationen återfick sin förmåga att växa och reproducera en tid efter behandling med denna höga koncentration av IPTG (ytterligare fil 1: Fig. S8).

tidskurserna för TCP-biotransformation med vilande celler av deg31 förinducerad med IPTG vid 1,00, 0,20, 0,05, 0,025 och 0,01 mM (ytterligare fil 1: Fig. S7) och densitometrisk analys av SDS-polyakrylamidgeler med motsvarande prover av cellfria extrakt (ytterligare fil 1: Fig. S9, tabell S1) visade att: i) det relativa förhållandet mellan banenzymer och formen på nedbrytningsprofilen förändrades inte väsentligt med inducerkoncentrationen, medan II) innehållet i de tre banenzymerna i det totala lösliga proteinet i de rekombinanta bakterierna minskade från 55% (1 mM IPTG) till 32% (0,01 mM IPTG) och banans produktion minskade från 70 till 46 %. Märkbar omvandling av TCP uppnåddes också med icke-inducerade celler på grund av läckage av T7-promotorn och basalt uttryck av gener inom vägen (ytterligare fil 1: Fig. S7).

Figur 5 sammanfattar balansen mellan de tre parametrarna som diskuterats i föregående avsnitt: (i) värdviabilitet, (ii) det cellulära uttrycket av vägenzymer och (iii) utsignalen från den syntetiska biologiska nedbrytningsvägen. Vi drar slutsatsen att den minimala IPTG-koncentrationen som möjliggör tillräckligt uttryck av gener inom vägen för att uppnå en rimlig utgång är 0,025 mm. liknande inducerkoncentrationer som tillåter fullständigt genuttryck har rapporterats för enstaka rekombinanta proteiner såsom sackarios-galaktosidas, grönt fluorescerande protein och rhamnulosa-1-fosfataldolas. Observera att IPTG-koncentrationen på 0,025 mM är åtta gånger lägre än den ursprungligen testade inducerkoncentrationen och upp till 40 gånger lägre än de värden som rapporterats i den vetenskapliga litteraturen som beskriver teknik av heterologa vägar i E. coli . Induktion med lägre mängder IPTG förbättrade värdens kondition. Men även den lägsta koncentrationen av 0,01 mM minskade livskraften hos E. coli-nedbrytaren med 30% i förhållande till icke-inducerad deg31 och med upp till 50% i förhållande till den icke-inducerade värdkontrollen (P < 0,05 i båda fallen; Fig. 4b). Vi undersökte därför möjligheten att ersätta IPTG med en alternativ inducerare.

minska metabolisk börda och toxicitet exacerbation genom att inducera med laktos

laktos är en naturlig inducerare av lac operon och kan användas som ett billigare alternativ till syntetisk IPTG. Det har visat sig inducera uttryck av rekombinanta proteiner i E. coli i samma utsträckning som IPTG på både laboratorie-och industriskala . I motsats till IPTG är laktos ett substrat av Tubi-galaktosidas(kodat av lacZ) och kan således metaboliseras av celler med en intakt lac-operon, inklusive E. coli BL21 (de3). Därför används koncentrationer av laktos upp till 30 mM ofta för att inducera uttrycket av klonade gener vid nivåer som kan uppnås med 1 mm IPTG i 1 mm.

vi undersökte förinduktion av deg31-celler med 1 mM laktos. Vi antog att denna koncentration skulle vara tillräcklig för att inducera uttrycket av TCP-nedbrytningsvägsgenerna vid nivåer som skulle ge tillräcklig nedbrytningseffektivitet. Denna förväntan bekräftades av registrerade tidskurser för TCP-biotransformation och upptäckten att vägenzymer stod för upp till 41% av cellernas totala lösliga protein under dessa förhållanden (ytterligare fil 1: fig. S7 och S9, och tabell S1). Den teoretiska omvandlingen av TCP till glycerol under dessa förhållanden var 63 %. Dessa värden ligger nära de som observerats för deg31-celler förinducerade med 0, 025 eller 0, 05 mM IPTG. Viktigast av allt uppvisade deg31-cellerna förinducerade med laktos högre livskraft före och efter 5 h inkubation med TCP jämfört med bakterier behandlade med IPTG vid någon av de testade koncentrationerna (P < 0,05; Fig. 4). Samma lindrande effekt observerades för värdkontrollen. När det gäller överlevnad utförde cellerna Pre-inducerade med laktos nästan lika bra som deras icke-inducerade motsvarigheter (Fig. 4c). I enlighet med pläteringsresultaten avslöjade flödescytometrisk analys av värdkontroll och deg31-celler som förinducerades med laktos signifikant lägre nivåer av stressade celler med depolariserade membran än vad som observerades för E. coli-stammar som förinducerades med IPTG (P < 0,01; ytterligare fil 1: Fig. S10). Dessa resultat indikerade igen att verkan av IPTG i de studerade rekombinanterna konsekvent åtföljdes av förändringar i membranegenskaper.

en högre livskraft hos celler inducerade med laktos istället för IPTG rapporterades tidigare för uttryck av enstaka heterologa proteiner . Denna effekt tillskrevs den försenade, mildare induktionen som uppnåddes med den naturliga induceraren. Till skillnad från syntetisk IPTG, som snabbt kan komma in i cellen både genom passiv diffusion och med hjälp av lacy-laktospermeasen, kan laktos bara komma in i cytoplasman via permeasen. Dessutom måste laktos omvandlas till allolaktos med hjälp av bacill-galaktosidas innan den binds till Lac-repressorn medan IPTG binder direkt till repressorn. Våra resultat bekräftar att laktos medför en lägre metabolisk börda än IPTG, vilket tyder på att det också är en mer lämplig inducerare för uttryck av hela heterologa vägar i E. coli BL21(DE3). Detta är särskilt viktigt för E. coli BL21(DE3) celler som bär syntetiska vägar som bryter ned giftiga föreningar eller producerar giftiga mellanprodukter.