Gelfiltreringskromatografi

Gelfiltreringskromatografiapplikationer

Gelfiltreringskromatografi, en typ av uteslutningskromatografi av storlek, kan användas för att antingen fraktionera molekyler och komplex i ett prov i fraktioner med ett visst storleksintervall, för att avlägsna alla molekyler som är större än en viss storlek från provet, eller en kombination av båda operationerna. Gelfiltreringskromatografi kan användas för att separera föreningar såsom små molekyler, proteiner, proteinkomplex, polysackarider och nukleinsyror i vattenlösning. När ett organiskt lösningsmedel används som mobil fas kallas processen istället för gelpermeationskromatografi.

gelfiltreringskromatografi kan också användas för:

• fraktionering av molekyler och komplex inom ett förutbestämt storleksintervall
• storleksanalys och bestämning
• avlägsnande av stora proteiner och komplex
• Buffertutbyte
• avsaltning
• avlägsnande av små molekyler såsom nukleotider, primers, färgämnen och föroreningar
• bedömning av provrenhet
• separering av bundna från obundna radioisotoper

gelfiltreringskromatografimedier för alla ovanstående användningar finns i färdigförpackade gravitationsflödeskolonner, Spinnkolonner, lågtrycks-och medeltryckskromatografikolumner och flaskhartser.

Gelfiltreringskromatografimekanism

i en gelfiltreringskromatografikolonn består den stationära fasen av en porös matris och den mobila fasen är bufferten som flyter in mellan matrispärlorna. Pärlorna har ett definierat porstorleksområde, känt som fraktioneringsområdet. Molekyler och komplex som är för stora för att komma in i porerna stannar i mobilfasen och rör sig genom kolonnen med buffertens flöde. Mindre molekyler och komplex som kan röra sig in i porerna går in i den stationära fasen och rör sig genom gelfiltreringskolonnen med en längre väg genom pärlarnas porer.

varje molekyl eller komplex som ligger över fraktioneringsområdet för en viss gelfiltreringskromatografikolonn kommer att röra sig genom kolonnen snabbare än någon molekyl som kan komma in i den stationära fasen. Därför kommer varje beståndsdel i provet som ligger över fraktioneringsområdet att eluera först (i tomrumsvolymen) före något som ligger i fraktioneringsområdet. Den minsta storleken som kommer att förbli i mobilfasen och inte gå in i den stationära fasen kallas uteslutningsgränsen. Bio-Rad erbjuder gelfiltreringskromatografimedier och kolumner med uteslutningsgränser som sträcker sig över tre storleksordningar, från 100 Dalton till 100 000 dalton (100 kDa).

molekyler och komplex som kan komma in i den stationära fasen kommer att fraktioneras enligt deras storlekar. Mindre molekyler kommer att migrera djupt in i porerna och kommer att fördröjas mer än större molekyler som inte så lätt kommer in i porerna och därmed elueras snabbare från kolonnen. Denna skillnad i pormigration leder till fraktionering av komponenter efter storlek med den största elueringen först.

i gelfiltreringskromatografikolumner avsedda för avsaltning, buffertutbyte och avlägsnande av små molekyler såsom nukleotider, kommer salterna och små föreningar lätt in i porerna, fördröjs och migrerar långsammare genom kolonnen än de större proteinerna eller nukleinsyrorna. Därför elueras komponenterna av intresse i provet i förväg av salter, nukleotider etc. DNA-rengöringssatser som använder denna mekanism innehåller ofta gelfiltreringsspinnkolumner.

upplösning, här definierad som skärpan i gränserna mellan storleksfraktioner, bestäms av pärlstorlek och ett antal andra faktorer. Mindre pärlstorlek ger i allmänhet högre upplösning i en gelfiltreringskromatografikolonn. Kompakta molekyler diffunderar genom den stationära fasen snabbare än linjära molekyler. Storlek uteslutning, fraktioneringsområde och elueringshastighet påverkas av buffertkomposition, jonstyrka och pH. för fraktionering av komplexa blandningar av proteiner kan elueringstider och storlek uteslutningsgränser behöva bestämmas empiriskt.

gelfiltrering kromatografi Media

ett viktigt kriterium för gelfiltrering kromatografi media är att media är inert och att ingenting i provet eller någon buffert binder till media. Ett annat övervägande är typen av gelfiltreringskolonn som används och om den används i ett trycksatt kromatografisystem eller gravitationsflöde eller spinnkolumner. Om ett trycksatt kromatografisystem används måste både kolonnen och mediet kunna tolerera det tryck och flödeshastigheter som används.

vanligen använda medier för gelfiltrering kromatografi är baserade på agaros eller polyakrylamid pärlor, dextros för gravitation eller lågtryckssystem, och polymera hartser för medeltryckssystem. Valet av media beror på egenskaperna hos de komponenter som ska separeras och andra experimentella faktorer. Följande är allmänna överväganden vid bestämning av valet av gelfiltreringskromatografimedia:

• Fraktioneringsområde
• storlek uteslutningsgräns
• arbetstryck
• flödeshastighet
• provviskositet
• pH-intervall
• Autoklaverbarhet
• tolerans för blandbart vatten organiska lösningsmedel; vissa prover kan vara mer lösliga i en vatten-organisk blandning
• tolerans för tvättmedel, chaotropa medel, formamid etc.
• Driftstemperatur

typerna av prover, val av media och kromatografisystemet kommer att avgöra vilka parametrar som är viktigast för en given reningsapplikation.