gränser i mikrobiologi

introduktion

invasiv aspergillos (IA) är en potentiellt livshotande sjukdom, som oftast förekommer hos allvarligt immunkompromitterade patienter som de med akut myeloid leukemi, de med långvarig neutropeni på grund av myelotoxisk terapi, eller efter allogen hematopoietisk celltransplantation eller fast organtransplantation, och beräknas påverka cirka 200 000 patienter per år (Brown et al., 2012). Tidig initiering av terapi är viktig för förbättrad överlevnad, men diagnosen är fortfarande notoriskt svår, särskilt när man förlitar sig på konventionell kultur eller mikroskopi (Lamoth och Calandra, 2017). På grund av detta har nya biomarkörer för tidig diagnos av IA introducerats under de senaste 2 decennierna. Vi har sammanfattat fördelarna och nackdelarna med dessa tester i Tabell 1. Den diagnostiska prestandan hos dessa biomarkörer kan förbättras ytterligare genom att använda dem som en kombination av tester (Aguado et al., 2015; Neofytos et al., 2015).

galaktomannan (GM) tillhör en grupp polysackarider som består av en mannos ryggrad och ett varierande antal galaktofuran sidokedjor. GM utgör en stor del av cellväggen i Aspergillus spp. (Latg bisexual et al., 1994). Dessa galaktofuranoshaltiga polysackarider varierar i storlek från 35 till 200 kDa och utsöndras in vivo av svampen under invasiv tillväxt. Under de senaste åren har detektion av galaktofuranosinnehållande antigener, inklusive GM, använts för att diagnostisera invasiv aspergillos (IA). Hittills är den vanligaste metoden för att bestämma GM i serum och bronko-alveolär spolning (BAL) vätska en dubbel sandwich enzymbunden immunanalys (Platelia Aspergillus antigen, Bio-Rad, Marnes-la-Cocquette, Frankrike). Denna analys är baserad på den rått-härledda EB-A2 monoklonala IgM-antikroppen, som fungerar som infångnings-och detektorantikropp, och som selektivt binder till fyra eller fler 6UG(1UG 5) galaktofuranosylrester av GM (Mennink-Kersten et al., 2004). Denna analys är godkänd av US Food and Drug Administration, kommersiellt tillgänglig, och har införlivats som ett mikrobiologiskt kriterium i European Organization for Research and Treatment of Cancer-Mycosis Study Group konsensusdefinitioner av invasiv svampsjukdom (Pauw et al., 2008). Även om denna analys endast har godkänts för användning i serum och BAL-vätska, framgångsrik bestämning av GM i andra matriser såsom cerebrospinalvätska (Chong et al., 2016), urin (Reischies et al., 2016), plasma (vit et al., 2013) och vätska från abscesser (Verweij et al., 2000) har också rapporterats. Resultaten rapporteras som ett optiskt densitetsindex (ODI), där absorbansvärdet för ett kliniskt prov jämförs med medelvärdet av två referensprover (cut-off-kontroller) som tillhandahålls av tillverkaren. Absorptionsnivåerna är emellertid endast tillförlitliga inom ett givet intervall, beroende på vilken typ av fotometer som används. Detta utgör en stor begränsning av analysen. Vid högre optiska densiteter blir förhållandet mellan koncentrationen av GM och absorbansvärdet icke-linjärt (Figur 1), vilket resulterar i underskattning av koncentrationer över det linjära området. Eftersom den optiska densiteten hos referensstandarderna kan variera mellan analyskörningar, kan cutoff vid vilken analysen blir icke-linjär också vara variabel. Enligt tillverkarens instruktioner måste den genomsnittliga optiska densiteten hos avstängningsreglagen vara 0,300 och 0,800 0,800. Till exempel en fotometer av god kvalitet med ett linjärt intervall upp till en absorbans av 2.5 kommer därför att kunna exakt rapportera en ODI mellan 8.33 (för en genomsnittlig avstängningskontroll på 0.300) och 3.13 (för en genomsnittlig avstängningskontroll på 0.800). I en fotometer av lägre kvalitet med ett linjärt intervall upp till en absorbans på 1,0 kan denna gräns för tillförlitlig kvantifiering vara så låg som 1,25 (för en genomsnittlig avstängningskontroll på 0,800). Som sådan bör små variationer av höga ODI tolkas med försiktighet. För en noggrann bestämning av högre värden av GM (utanför det linjära området) bör ELISA upprepas i seriellt utspädda prover, eller andra, mer exakta metoder såsom masspektrometri bör användas. För närvarande rekommenderar tillverkaren en cut-off på 0,5 i både serum och BAL. På grund av det stora antalet falska positiva effekter i BAL vid denna cutoff föreslås dock en högre cutoff på 1.0 i den kommande översynen av EORTC-MSG-kriterierna.

testegenskaperna och begränsningarna för GM-detektion för diagnos av IA har studerats väl och har varit föremål för flera metaanalyser (Pfeiffer et al., 2006; Zou et al., 2012; Leeflang et al., 2015). Förutom att ge information om diagnos har serum GM (sGM) också undersökts för att förutsäga resultatet efter påbörjad behandling, särskilt eftersom testet är lätt att utföra, allmänt tillgängligt, till stor del Aspergillus specifikt, standardiserat och objektivt. SGM-koncentrationen in vivo bestäms emellertid inte bara av produktionshastigheten och utsöndringen av den växande svampen utan också av upptagningshastigheten i blodet, liksom elimineringshastigheten från cirkulationen.

på grund av den relativa stora storleken på GM kan antigenet inte fritt diffundera från alveolerna genom endotelfodret i lungkapillärerna; angio-invasion krävs för att nå cirkulationen. Detta bekräftades i en in vitro-modell av humana alveoler, där GM endast uppträdde i blodomloppet efter invasiv tillväxt av Aspergillus genom det alveolära kapillärmembranet (Hope et al., 2007). Uppenbarligen, som tydligt visat i histopatologiska studier och studier med kvantitativ polymeraskedjereaktion (PCR), varierar graden av angio-invasion (och därmed svampbörda) med arten av det underliggande tillståndet, med massiv invasion och en hög svampbörda i neutropeniska modeller och övervägande inflammation med liten invasion och en låg svampbörda i steroidinducerade modeller (Sheppard et al., 2006). Produktionen av GM påverkas ytterligare av terapi; detta förklarar den minskade känsligheten för SGM-detektion hos patienter som får mögelaktiv terapi (Leeflang et al., 2015). Detta resultat bekräftades i djurmodeller, där en koncentrationsberoende effekt på SGM-detektion visades för triazoler, polyener och undersökningsläkemedel såsom orotomiderna (Petraitiene et al., 2001; Petraitis et al., 2016; Kimura et al., 2017; Negri et al., 2017). En modell visade en paradoxal ökning av sGM efter behandling med caspofungin (Petraitiene et al., 2002), potentiellt på grund av störningar i svampcellväggssyntes. Andra modeller som använder echinocandiner kunde emellertid inte replikera detta fenomen (Miceli och Anaissie, 2007). Det är mer troligt att den ”paradoxala effekten” orsakades av ineffektiv terapi vilket resulterade i ökad svampbelastning snarare än en ökad frisättning från cellväggen, eftersom echinocandiner har visat sig ha begränsad aktivitet mot Aspergillus spp. hos människor (Viscoli et al., 2009). I de flesta jämförande djurmodeller sågs ingen skillnad i SGM-kinetik mellan olika svampdödande läkemedel jämfört med samma effektnivå.

eliminering av sGM sker via olika vägar in vivo. Använda radioaktivt märkt A. fumigatus GM, en råtta och kaninmodell av IA visade leverkoncentration på ungefär en tredjedel av den initialt injicerade dosen via upptag i Kupffer-celler (Bennett et al., 1987). Makrofagmannosreceptorn spelar en central roll i denna process eftersom leverupptaget minskade vid administrering av hämmare av denna receptor (Bennett et al., 1987). En annan tredjedel utsöndrades renalt inom 24 timmar, vilket är i linje med utseendet av GM i urinen hos patienter med IA (Reischies et al., 2016). Renal clearance beror också på njurfunktionen (och molekylens storlek), vilket vidare framgår av en fallrapport av IA hos en patient på hemodialys som hade ökande SGM-nivåer, trots adekvat behandling och klinisk förbättring (Saleeby et al., 2005). Slutligen tros neutrofiler också vara involverade i upptag och eliminering av cirkulerande GM. Detta skulle förklara den signifikant högre känsligheten för SGM-detektion hos neutropeniska patienter jämfört med icke-neutropeniska (Pfeiffer et al., 2006). Dessutom bekräftade en kaninmodell att lägre nivåer av sGM förekommer hos icke-neutropena kaniner jämfört med neutropena kaniner, medan ingen skillnad i GM kunde hittas i BAL-vätska (Petraitiene et al., 2015). Därför resulterar interaktionen mellan produktion och utsöndring under invasiv tillväxt, svampbelastningens storlek, Anti-mögelterapi, njur-och leverfunktion och neutropeniskt tillstånd i en komplex kinetisk profil för sGM.

för att bestämma det aktuella läget för GM: s roll och dess kinetik i resultatet av IA sökte vi MEDLINE-databasen via Pubmed med följande strukturerade fråga: (”galactomannan” eller ”galactomannan”) och (”prognos” eller ”prognos” eller svar eller ”terapi” eller ”terapi” eller ”behandling” eller ”terapi” eller ”terapi” eller ”terapi”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller” behandling ”eller” terapi ”eller” terapi ”eller ” resultat”). Av totalt 911 artiklar valdes 56 artiklar utifrån titel och abstrakt.

kinetik hos människor

vi kunde inte identifiera några data om kinetiken för sGM efter administrering till friska frivilliga, vilket skulle ge oss en detaljerad undersökning av dess kinetik och metabolism. Men olika källor till falsk positivitet (såsom GM-innehållande elektrolytlösningar eller beta-laktamantibiotika) tillåter viss inblick i dess kinetik i människokroppen. En studie tittade på sGM efter infusion av beta-laktamantibiotika hos patienter som tidigare var GM – seronegativa och som ansågs inte ha IA baserat på kliniska radiologiska tecken och symtom (Aubry et al., 2006). Efter infusion sågs en plötslig ökning av sGM. Baserat på de sjunkande SGM-nivåerna därefter uppskattade författarna en serumhalveringstid på 2,4 dagar för att eliminera sGM. Påverkande parametrar såsom kreatininclearance och neutrofilantal rapporterades emellertid inte. Huurneman et al föreslog en farmakokinetisk modell för utvecklingen av sGM under antimykotisk behandling (Figur 2), baserat på ett litet antal pediatriska patienter med IA som fick voriconazol med terapeutisk läkemedelsövervakning (Huurneman et al., 2016). Denna modell visade en bra passform med de faktiska värdena, men begränsades av det mycket lilla antalet faktiska SGM-mätningar, inkludering av möjliga fall av IA och genom att inte ta hänsyn till de tre olika metaboliska vägarna (njure, lever och neutrofiler).

effekt av GM vid baslinjen på resultat

vi identifierade 16 studier som tittade på GM vid baslinjen som en prediktor för respons och överlevnad (Tabell 2). Alla inkluderade studier använde Platelia-Aspergillus-antigenanalysen, men vid olika cut-offs. Alla studier inkluderade vuxna patienter med bevisad och sannolik IA, om inte annat anges i tabellen. Vi kunde inte identifiera motstridiga resultat mellan artiklarna: både statistiskt signifikanta resultat och icke-Signifikanta trender pekade i samma riktning.

sammantaget var det en stark och konsekvent korrelation mellan nivån av sGM och både kortvarig och långvarig överlevnad, från dag 42 till dag 180. I själva verket fann en väl utförd prospektiv randomiserad studie som jämförde anidulafungin i kombination med vorikonazol till vorikonazol ensam att baslinjen sGM endast var en av tre oberoende prediktorer för överlevnad i Vecka 6 i multivariat analys (Marr et al., 2015). Stratifiering av patienter efter SGM-positivitet vid baslinjen (med en cutoff på 0.5) uppdelade patienter i två grupper, med SGM-positiva patienter med signifikant högre dödlighet (Fisher et al., 2013; Hoyo et al., 2014; Kim et al., 2014; Neofytos et al., 2015; Jung et al., 2017). Tre grupper bestämde en annan cutoff av SGM 2.0 2.0 baserat på Youden index eller analys av området under kurvan (Fisher et al., 2013; Mikulska et al., 2013; Imbert et al., 2016). När stratifieras av denna cutoff, två studier fann en trend mot högre 42 och 90 dag all-orsak dödlighet (Mikulska et al., 2013; Imbert et al., 2016), med en annan studie som visar en statistiskt signifikant skillnad för både 6 veckors andningsdödlighet, 180 dagars andningsdödlighet samt 180 dagars dödlighet av alla orsaker (Fisher et al., 2013).

detta förhållande visar samspelet mellan två faktorer som bestämmer utvecklingen av svampsjukdom. Som visat tidigare korrelerar sGM med svampbörda. Som sådan kan en högre svampbörda (eller högre baslinje sGM) förväntas resultera i sämre resultat. Å andra sidan finns det länken mellan neutrofiler och GM, där neutrofiler är nödvändiga för att rensa både sGM och svampen själv. Faktum är att högre sGM vid diagnos har visat sig korrelera med lägre neutrofilantal (Jung et al., 2017).

en studie rapporterade också en signifikant koppling mellan BAL GM och överlevnad i Vecka 6 (L Avsugningsz-Medrano et al., 2016). Förhållandet mellan BAL GM och resultatet bör dock tolkas med försiktighet eftersom andra inte kunde replikera detta resultat. Observera att Bal GM-testning beror på infektionsstället, provtagningsplatsen (provtagningsfel), den icke-standardiserade samlingen av BAL-vätska, såväl som på den del av Bal-vätska som testats (Racil et al., 2011).

påverkan av GM-kinetik på resultat

vi identifierade 21 studier som tittade på GM-kinetik som prediktor för respons och överlevnad. Fyra beskrivande studier uteslöts på grund av bristen på en statistisk analys (Kwak et al., 2004; Maertens et al., 2005; Suankratay et al., 2006; Lai et al., 2007). Resten har sammanfattats i tabell 3. Alla inkluderade studier använde Platelia-Aspergillus-antigenanalysen. Alla studier inkluderade vuxna patienter med bevisad och sannolik IA, om inte annat anges i tabellen.

som med baslinjen sGM verkar det finnas en signifikant korrelation mellan utvecklingen av sGM efter baslinjen och resultatet. De flesta studier stratifierade patienter efter resultat (behandlingssvar eller överlevnad) och fann signifikanta skillnader i medelvärdet sGM-värden vid olika tidpunkter (Woods et al., 2007; Maertens et al., 2009; Nou Kubir et al., 2011, 2012; Park S. H. et al., 2011; Park S. Y. et al., 2011; Han et al., 2015; Neofytos et al., 2015; Vehreschild et al., 2017). Studierna som tog hänsyn till det ursprungliga SGM-värdet och som utvärderade nedgången, fann att detta också var en bra prediktor för resultatet (Boutboul et al., 2002; Koo et al., 2010; Khanna et al., 2013; Chai et al., 2014; Teering et al., 2014; Neofytos et al., 2015). Till exempel, en ökning av SGM-värden vid vecka 2 av 1,0 1,0 över baslinjevärdet, förutsagt terapifel vid vecka 6 med en känslighet på 66%, en specificitet på 87% och ett positivt prediktivt värde på 94% (Boutboul et al., 2002). Författarna valde cutoff på 1.0 eftersom de bestämde att detta var den minsta signifikanta variansen vid högre optiska index. Dessutom var en ihållande negativ sGM starkt associerad med goda resultat (Neofytos et al., 2015). I en annan studie förutspådde en komposit av normaliserat serum 1,3-Bisexuell-d-glukan (BDG, en annan biomarkör av IA) och sGM (med z-poäng) kliniskt svar vid vecka 6 och vecka 12 (Neofytos et al., 2015). Detta verkade dock helt bero på SGM-kinetiken eftersom BDG ensam inte heller kunde förutsäga, medan SGM-skillnaden mellan baslinjen och vecka 2 förutspådde kliniskt svar vid vecka 6 och vecka 12. Ingen studie kunde identifiera skillnader i sGM före vecka 1.

Chai et al. hittade distinkta kinetiska profiler beroende på antimykotisk behandling, med vorikonazolbehandling som visar tidigare SGM-clearance än amfotericin B-behandling (Chai et al., 2014). Detta står dock i kontrast till djurmodeller där ingen skillnad i SGM-kinetik kunde ses mellan azol-och polyenbehandling (Petraitiene et al., 2001). Dessutom fann en annan studie på 93 patienter inga skillnader i Profiler mellan de använda svampdödande läkemedlen (Koo et al., 2010).

påverkan av andra biomarkörer på resultat och överlevnad

förutom GM används andra kvantitativa biomarkörer för att diagnostisera IA såsom BDG och Aspergillus PCR. Dessa kan därför teoretiskt erbjuda kompletterande information om prognos och svar på terapi eftersom de har olika källor till produktion och eliminering. Faktum är att en minskande BDG vid vecka 2 har visat sig korrelera med överlevnad vid vecka 6 och vecka 12 (Neofytos et al., 2015). Denna nedgång var dock långsammare än nedgången i sGM och var mindre känslig för att förutsäga terapisvar. Nedgången verkar dock ha en inverkan på överlevnaden: en nedgång i BDG-nivåer på 2,51 pg/mL/dag hade en känslighet på 73,5% och specificitet på 83,5% för att förutsäga överlevnad (Pini et al., 2016). Serum koncentrationer av bis(metyltio)gliotoxin (bmGT), en sekundär metabolit av Aspergillus som har föreslagits som en kompletterande biomarkör, visade sig vara signifikant högre hos behandlade patienter som dog i dag 30 (2.36 ± 4.76 vs. 1.4 ± 7.58 mg/L, p < 0.01; Vidal-García et al., 2016).

i en annan studie visade en kvantitativ Aspergillus PCR god korrelation mellan initialt kopianummer och 90 dagars dödlighet, liksom mellan ihållande PCR-positivitet efter 2-3 veckor och 30 och 90 dagars dödlighet (Imbert et al., 2016). På liknande sätt korrelerade en minskning av cirkulerande Aspergillus-RNA mellan vecka 4 och vecka 6 svagt med Vecka 12-Svar (GHz = 0,621, p = 0,026) men inte med Vecka 6-Svar (Zhao et al., 2016). En relation mellan sGM och cirkulerande Aspergillus RNA kunde inte hittas. Som sådan verkar dessa icke-GM-biomarkörer vara särskilt användbara hos SGM-negativa patienter, men överträffas av sGM hos SGM-positiva patienter (som har en sämre prognos från början) och tillåter endast utvärdering av antimykotisk effekt under de senare behandlingsstadierna.

Vad är nästa?

data hittills indikerar en stark korrelation mellan både baslinje sGM och resultat, liksom mellan kinetiken för sGM och resultat. Dessa korrelationer baseras dock på genomsnittliga sGM-värden och erbjuder lite mervärde för hanteringen av den enskilda patienten, främst på grund av bristen på specifika tröskelvärden. Därför har flera författare föreslagit kliniska beslutsregler baserat på deras resultat. Validering av dessa föreslagna regler saknas emellertid, både i den ursprungliga populationen från vilken dessa har härletts, såväl som i externa valideringspopulationer. Som sådan är exakta indikatorer på noggrannhet, känslighet, specificitet och andra parametrar inte tillgängliga, vilket gör dessa föreslagna beslutsregler ännu inte lämpliga för användning i daglig klinisk praxis. Vidare behandlade ingen av de studier som diskuterades ovan, som använde Platelia Macau Aspergillus ELISA, frågan om icke-linjäritet av högre nivåer av sGM. Flera studier har tillämpat modifieringar av EORTC-MSG konsensusdefinitioner, mestadels inklusive andra värdkriterier som AIDS, cirros och kronisk obstruktiv lungsjukdom och andra kliniska kriterier, vilket gör jämförelse och tolkning av resultaten svårare. Dessutom lider många studier av lågt till mycket lågt antal SGM-prover per patient. Detta kringgås ibland genom att modellera den genomsnittliga kinetiken för sGM i befolkningen och använda denna modell för att förutsäga det förväntade värdet vid en viss tidpunkt baserat på tidigare värden. Den resulterande uppskattningen används sedan för vidare analys. Båda metoderna är i sig föremål för partiskhet eftersom de faktiska värdena vid tidpunkten för intresse är okända.

för närvarande använder kliniska prövningar som utvärderar svampdödande läkemedel främst överlevnad vid vecka 6 eller vecka 12 som det primära resultatet eller det kliniska svaret enligt definitionen i EORTC-MSG-kriterierna (Segal et al., 2008). Surrogatresultat för tidigare bedömning av effekt, vilket potentiellt skulle möjliggöra kortare varaktighet av kliniska prövningar, har föreslagits. En sådan slutpunkt definierar framgång som upprepade gånger negativ sGM (<0,5) i minst 2 veckor efter den första negativa sGM. Detta visade en god korrelation med överlevnad hos 56 hematologiska patienter (kappa-korrelationskoefficient 0,861, p < 0,0001), vilket är i linje med vad som kan förväntas från de kinetiska data som beskrivs ovan (Woods et al., 2007). Detta resultat bekräftades av tre oberoende studier på hematologiska patienter, som alla fann liknande kappa-korrelationskoefficienter mellan denna surrogatmarkör och kliniskt resultat och överlevnad (Maertens et al., 2009; Noujabi et al., 2011; Park S. H. et al., 2011). Denna definition tillåter emellertid inte utvärdering av effekt vid en förutbestämd slutpunkt (t.ex. efter 1 eller 2 veckors behandling), vilket kan vara mycket användbart för att styra beslutsfattandet. I denna inställning är en robust och tillräckligt validerad tidig surrogatmarkör ännu inte tillgänglig.

även om känsligheten hos sGM för diagnos av IA är lägre hos icke-neutropeniska patienter, mottagare av fasta organtransplantationer och patienter på mögelaktiv antifungal profylax, verkar de prognostiska egenskaperna hos sGM inte påverkas av detta. Flera studier inkluderade icke-neutropeniska patienter eller mottagare av fasta organtransplantationer (Koo et al., 2010; Park S. Y. et al., 2011; Russo et al., 2014; Teering et al., 2014; Neofytos et al., 2015; Imbert et al., 2016; Jung et al., 2017), eller tittade uteslutande på dessa populationer (Hoyo et al., 2014; Heylen et al., 2015; L., 2016). Resultaten från dessa studier var i linje med resultaten från studier på hematologiska patienter. Vi kunde inte identifiera några studier som tittade på skillnaden i kinetik mellan patienter på mögelaktiv antifungal profylax. Flera studier inkluderade emellertid denna population i sin övergripande analys (procentandel av studiepopulationen på mögelaktiv antifungal profylax: intervall 4,3-85%, median 50%) och fann resultat som liknar dem i populationer som inte är på profylax (Park S. Y. et al., 2011; Hoyo et al., 2014; Kim et al., 2014; L., 2016; Jung et al., 2017). Vi kan alltså dra slutsatsen att patienter med hög initial sGM och patienter med en sGM som inte minskar fortfarande har ökad risk för dåligt resultat, oberoende av det underliggande tillståndet eller profylaxen. Den exakta kinetiken kan emellertid skilja sig mellan dessa olika populationer och har inte studerats i detalj.

slutsats

baslinje sGM och trender i SGM-kinetik korrelerar med resultatet (både svar och överlevnad) i IA. Dessutom verkar sGM ha tidig prognostisk potential, särskilt hos hematologiska patienter. Ytterligare studier är emellertid brådskande nödvändiga för att bestämma de exakta kliniskt relevanta brytpunkterna och deras testegenskaper, följt av validering i både hematologiska och icke-hematologiska populationer. Dessutom verkar flera andra biomarkörer som BDG, bmGT och Aspergillus DNA eller RNA erbjuda ytterligare och Kompletterande information, även om mängden bevis för dessa biomarkörer är ännu gles.

Författarbidrag

TM var inblandad i datainsamling och utarbetande av artikeln. TM, EG, KL och JM var inblandade i kritisk revision av artikeln och slutligt godkännande av den version som skulle publiceras.

intressekonflikt uttalande

TM har fått föreläsning honoraria från Gilead och resestöd från MSD och Gilead. JM har fått forskningsbidrag, resestöd och föreläsning honoraria från Gilead, MSD, Basilea Pharmaceuticals, Astellas och Pfizer och har deltagit i advisory boards för MSD, Gilead, Astellas, Basilea, Pfizer, F2G, Amplyx, Scynexis och Cidara. KL har fått forskningsbidrag, resestöd och föreläsning honoraria från Gilead, MSD och Pfizer. Hon deltog i rådgivande styrelser för MSD och Gilead.

den andra författaren förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiella eller finansiella relationer som kan tolkas som en potentiell intressekonflikt.