resultat och diskussion
PCR-RFLP-analys avslöjade restriktionsmönster kompatibla med in silico-analys. Alla hundar med svansmiformation presenterade samma mönster (3 fragment, 2 synliga band), vilket skilde sig från det som presenterades av hundar med normal svans (2 fragment, 1 synligt band) (Fig.1). En annan analys, även baserad på PCR-RFLP, användes framgångsrikt för att identifiera samma mutation i hundens t-gen, men med användning av ett polyakrylamidgelelektroforessystem (Gruszczynska & Czapla 2011). Utförandet av polyakrylamidgelelektrofores kan förbättra upplösningen av band i förhållande till DNA-fragment i föreliggande studie. Praktiken skulle dock minskas, eftersom detta system är mer mödosamt. I den aktuella studien, även om det inte var möjligt att visualisera alla DNA-fragment som genererades efter matsmältningen, var det möjligt att enkelt skilja genotyper med användning av agarosgelelektrofores.
Fig.1. PCR-RFLP för detektering av c189g-mutation. Markör för baspar (M), drabbade hundar – kort svans (1-7) och djur med normal svans (8).
i analysen av sekvenserade prover observerades heterozygositet C (cytosin) G (guanin) i nukleotid 189 av exon 1 endast hos hundar med svansmiformation. Platsen för mutationen baserades på T-genen mRNA-sekvens tillgänglig i genbanken (anslutningsnummer: AJ245513).
vid in silico-analysen observerades också förändring av aminosyra 63 Från isoleucin till metionin. Alla DNA-sekvenser erhållna i den aktuella studien deponerades i Genbank under anslutningsnummer: MF495488 (kort svans), MF495489 (frånvaro av svans), MF495490 (frånvaro av svans) och mf495491 (normal svans).
även om endast en genotyp hittades för det nuvarande tillståndet (kg för djur med svansmiformation) observerades en fenotypisk variation hos drabbade hundar, vilket är svansstorleken. Vissa djur presenterade kort svans (ungefär 3-4 ryggkotor), och andra visade frånvaro av svans (ungefär 1-2 ryggkotor) (Fig.2). Liknande fenotyper observerades också av Haworth et al. (2001) hos hundar. Även om en förklaring till detta ännu inte är känd hos hundar, Buckingham et al. (2013), som studerade medfödd svansstorleksvariation hos katter, fann bevis på haploinsufficiency orsakad av flera mutationer i T-genen. C. 1199delc, c.1169delc och c.998delt mutationer var associerade med olika nivåer av genuttryck, vilket kan förklara de olika fenotyperna bland hundar med svansmiformation (Buckingham et al. 2013).
Fig.2. (A) Hundbärande mutation C189G i T-genen. (B) hund från samma kull utan c189g-mutation.
mutationens ärftliga karaktär kan bevisas med heredogramanalysen (Fig.3) av kullen studerade. Det var möjligt att verifiera att mutationen har ett autosomalt dominerande arvsmönster. Emellertid hittades ingen dominerande homozygot (GG) genotyp i den aktuella studien, vilket förstärkte observationerna att när den är i homozygos orsakar den muterade T-genen fosterdöd (Haworth et al. 2001). Hytonen et al. (2009) observerade att kullar från korsningar mellan normalstjärtade djur (CC-genotyp) var 29% större än kullar från korsavel mellan missbildade svansdjur (CG-genotyp). Detta resultat är kompatibelt med den förväntade minskningen av 25% hos avkommor från kors som involverar dödliga alleler.
Fig.3. Heredogram som visar arvsmönstret för c189g-mutationen i T-genen av Labrador Retriever. Korsning mellan morföräldrar (i), kull av den drabbade hunden och dess korsning med normal hane (II) och kull analyseras (III).
mutationer i T-genen har associerats med svansmiformation hos andra arter som möss och katter (Wilson et al. 1995, Buckingham et al. 2013). Och i vissa av dem observeras också andra förändringar, såsom urin-och fekal inkontinens hos katter (Robinson 1993). Men hos hundar har hittills endast svansmiformation observerats hos heterozygota djur (CG) (Indrebo et al. 2008). Även om fenotypen ”svansmiformation” i vissa hundraser inte var associerad med c189g-mutationen (Boston Terrier, Engelsk Bulldog, King Charles Spaniel, miniatyrschnauzer, Parson Russell Terrier och Rottweiler), föreslår det stora antalet raser som påverkas en gammal mutation (Hytonen et al. 2009), att vara närvarande i förfäderhundar före bildandet av många raser. Emellertid kan interracial korsning också ha bidragit till mutationsdiffusion, eftersom CG heterozygota djur verkar inte ha någon libido eller reproduktiv prestanda förändringar. En annan faktor som kan ha bidragit till mutationsdiffusion var användningen vid reproduktion av hundar utan svans, när estetisk caudektomi fortfarande var tillåten. Under denna period är det troligt att många djur med svansagenes har använts som reproducerare, eftersom svansfrånvaro var önskvärd hos vissa raser, vilket bidrog till mutationsdiffusionen.
för närvarande är utövandet av caudektomi (kirurgisk svansavlägsnande) ett förbjudet förfarande i flera länder i världen, såsom de i Europeiska unionen och Brasilien (Haworth et al. 2001, CFMV 2013). I vissa EU-länder används genetiska tester för att identifiera c189g-mutationen i T-genen för att verifiera om frånvaron av svans hos vissa raser är av medfödd ursprung eller djuren genomgick oregelbundet kirurgiskt ingrepp. PCR-RFLP som användes i föreliggande studie var en enkel och exakt teknik för att identifiera denna mutation och kunde användas som bevis för att identifiera olaglig caudektomipraxis.
på grund av bristen på information om c189g-mutationen i hundens t-gen finns det ingen ytterligare information om dess samband med andra morfologiska eller till och med fysiologiska tecken och behöver därför undersökas.