en liknande genetisk kod används av de flesta organismer på jorden, men olika organismer har olika preferenser för de kodon som de använder för att koda specifika aminosyror. Detta är möjligt eftersom det finns 4 baser (A, T, C och G) och 3 positioner i varje kodon. Det finns därför 64 möjliga kodoner men endast 20 aminosyror och 3 stoppkodoner för att koda och lämna 41 kodoner oredovisade för. Resultatet är redundans; flera kodoner kodar för enstaka aminosyror. Evolutionära begränsningar har gjutit vilka kodoner som används företrädesvis i vilka organismer-organismer har kodonanvändningsförspänning.
du kan hitta många kodontabeller som visar vilka kodon som kodar vilka aminosyror (se exempel till höger). Med sådana enkla regler kanske du tror att det är lätt att komma fram till en fungerande DNA-sekvens för att koda din peptid av intresse och producera den peptiden i din valfria organism. Tyvärr gör kodonpreferenser det så att du inte kan välja bland de möjliga kodonerna slumpmässigt och förvänta dig att din sekvens ska uttrycka sig bra i någon organism.
så vad är de evolutionära begränsningarna som leder till dessa preferenser och vad kan vi göra åt dem? Läs vidare för att ta reda på det!
varför har organismer olika kodonanvändningsfördomar?
orsakerna till olika kodonpreferenser bland organismer är inte helt förstådda, men några möjliga orsaker är:
- metaboliskt tryck-det tar cellulära resurser att producera tRNA som känner igen olika kodoner, modifierar tRNA korrekt och laddar tRNA med lämpliga aminosyror. Om en organism endast använder en delmängd kodoner behöver den bara producera en delmängd laddade tRNA och kan därför behöva färre resurser för hela översättningsprocessen. Till exempel, under förhållanden med hög tillväxt, uppreglerar E. coli företrädesvis produktion av tRNA som känner igen kodoner som finns i starkt uttryckta gener (Emilsson och Kurland, 1990).
- kontroll av genuttryck genom gensekvens – proteiner som kodas av kodoner med låg överflöd eller dåligt laddade tRNA kan produceras med en lägre hastighet än proteiner som kodas av mycket rikliga, laddade tRNA. Till exempel Tuller et al. fann att översättningseffektivitet är väl korrelerad med kodonförspänning i både E. coli och S. cerevisiae.
- proteinvikning – om ett protein kodas av en blandning av kodoner med högt och dåligt laddade tRNA, kan olika regioner av proteinet översättas med olika hastigheter. Ribosomen kommer att röra sig snabbt längs regioner som kräver rikliga, laddade tRNA men kommer att stanna i regioner som kräver låg överflöd, dåligt laddade tRNA. När ribosomen stannar kan detta ge de snabbt översatta regionerna en chans att vikas ordentligt. Till exempel pechmann och Frydman fann att områden av icke-optimala kodoner är associerade med specifika sekundära strukturer i 10 närbesläktade jäststammar.
- anpassning till förändrade förhållanden – organismer behöver ofta uttrycka gener på olika nivåer under olika förhållanden. Med varierad kodonanvändning kan en organism ändra vilka proteiner som är mycket uttryckta och vilka är dåligt uttryckta genom att producera och ladda specifika tRNA-pooler. Till exempel, tRNA som används i gener som kodar för aminosyrabiosyntetiska enzymer kan företrädesvis laddas under aminosyra svält vilket resulterar i högre produktion av aminosyrabiosyntetiska enzymer (Dittmar et al., 2005).
hur påverkar codon usage bias mina experiment?
medan kodonpreferenser kan vara mycket användbara för organismer, kan de vara problematiska för forskare som försöker uttrycka proteiner i heterologa värdar. Om du bara förstärker en gen av intresse från det mänskliga genomet, kan det till exempel inte uttrycka alls i E. coli (du kan hitta en mängd olika databaser som visar olika organismers kodonpreferenser online). Även om genen översätts kanske den inte fungerar korrekt. Detta är resultatet av en felaktig matchning mellan mänsklig och E. coli kodonpreferens. Vissa kodon som vanligtvis används hos människor är inte alls vanliga i E. coli och vice versa. Vid översättning av dessa kodoner kan ribosomen därför stanna på olämpliga platser eller misslyckas med att göra det genom hela transkriptet vilket resulterar i produktion av icke-funktionella proteiner respektive proteinfragment.
lösa problemet med kodonanvändning bias – kodon optimering och uttrycket av alternativa tRNA
kodon optimering
med låg kostnad DNA-syntes, en av de primära sätt forskarna lösa problemet med kodon val är att återsyntetisera gener på ett sådant sätt att deras kodon är mer lämpliga för det önskade uttrycket värd. Detta kallas ” kodonoptimering.”Även om det är enkelt i teorin är det inte så enkelt som det låter. Även för relativt korta peptider kan det finnas många möjliga sätt att koda dem och vad som utgör det ”lämpliga” kodonet är inte nödvändigtvis uppenbart.
du kanske tror, ” nonsens! Jag borde bara välja kodonet med den mest rikliga poolen av laddade tRNA i min värdorganisme för varje aminosyra som jag skulle vilja koda,” men som beskrivet ovan bör inte varje region av ett protein nödvändigtvis översättas snabbt för att producera ett protein som fungerar korrekt.
du kanske då tänker, ”Okej, Jag ska bara se till att överflöd av kodonerna jag väljer för värden matchar överflöd av kodon som används i den inhemska organismen.”Detta är möjligen en bättre IDE och har använts framgångsrikt tidigare (Angov et al., 2008), men det finns fortfarande många fler funktioner att tänka på när man utformar en full gen. En icke uttömmande lista innehåller:
- Kodonöverflöd i förhållande till kognat tRNA-överflöd
- repetitiva sekvenser
- restriktionsställen
- sekvenser benägna att skapa sekundära strukturer i RNA-transkript
- effekter på transkription (kom ihåg att det inte handlar om översättning – t. ex. kodonval kan avbryta transkriptionsfaktorbindningsställen)
som du kan föreställa dig är det inte lätt för människor att balansera alla dessa faktorer på egen hand. Lyckligtvis har många forskare skapat kodonoptimeringsalgoritmer och DNA-syntesföretag som IDT och GenScript host online kodonoptimeringsverktyg. Tänk på att bara för att du optimerar en gen med ett av dessa verktyg betyder det inte nödvändigtvis att genen kommer att uttrycka sig bra. Om du får bra uttryck bör du också funktionellt analysera det producerade proteinet för att säkerställa att det har vikts ordentligt.
du kanske kan undvika att få dina gener av intresse kodon optimerad genom att beställa plasmider som innehåller dem från Addgene. Om en plasmid på Addgene innehåller en gen som har kodon optimerats för en viss organism, kommer detta ibland (men inte alltid) att noteras i fältet ”mutation” på plasmidsidan (se plasmid 87904 till exempel). Eftersom många plasmider som finns tillgängliga från Addgene nu har fullständiga sekvensdata rekommenderar vi att du direkt analyserar gensekvenser för kodonoptimering och lämplighet för din expressionsvärd innan du använder dem i dina experiment.
uttryck av alternativa tRNA
om du inte har tid eller medel för att syntetisera en kodonoptimerad version av din gen av intresse, är det möjligt att överuttrycka tRNA med lågt överflöd i din uttrycksvärd och därmed öka deras överflöd. Till exempel uttrycker de kommersiella Rosetta E. coli-stammarna en mängd tRNA som normalt finns vid låg överflöd i E. coli.
fördelen med att producera ytterligare tRNA är att du kan använda samma uttryckssystem för många olika gener utan att behöva skapa nya konstruktioner. På grund av problem som felaktiga översättningshastigheter och potentiella effekter på celltillväxt kan även värdar som producerar alternativa tRNA inte uttrycka tillräckliga mängder av ditt protein av intresse.
oavsett vilken metod du väljer att övervinna problemen kring kodonval, bör du ha någon metod för att se till att proteinerna du producerar fungerar korrekt. Överuttryck kan resultera i produktion av olösliga, icke-funktionella globs av protein som kallas inklusionskroppar som i allmänhet kommer att segregera med cellpelleten under reningsprocedurer. Även om du producerar en stor mängd protein i ditt uttrycksvärde, bör du utföra en funktionell analys för att se till att ditt protein inte bildar inklusionskroppar och viks ordentligt.
1. Angov, Evelina, et al. ”Heterologt proteinuttryck förbättras genom att harmonisera kodonanvändningsfrekvenserna för målgenen med uttrycksvärdens.”PloS en 3.5 (2008): e2189. PubMed PMID: 18478103. PubMed centrala PMCID: PMC2364656.
2. Dittmar, Kimberly A., et al. ”Selektiv laddning av tRNA-isoacceptorer inducerad av aminosyra‐svält.”EMBO rapporterar 6.2 (2005): 151-157. PubMed PMID: 15678157. PubMed Central PMCID: PMC1299251.
3. Emilsson, Valur och Charles G. Kurland. ”Tillväxttakt beroende av överföring RNA överflöd i Escherichia coli.”EMBO journal 9.13 (1990): 4359-4366. PubMed PMID: 2265611. PubMed Central PMCID: PMC552224.
4. Gustafsson, Claes, Sridhar Govindarajan och Jeremy Minshull. ”Kodonförspänning och heterologt proteinuttryck.”Trender inom bioteknik 22.7 (2004): 346-353. PubMed PMID: 15245907.
5. Maertens, Barbara, et al. ”Genoptimeringsmekanismer: en multigenstudie avslöjar en hög framgångsgrad för fullängds humana proteiner uttryckta i Escherichia coli.”Proteinvetenskap 19.7 (2010): 1312-1326. PubMed PMID: 20506237. PubMed Central PMCID: PMC2970903.
6. Pechmann, Sebastian och Judith Frydman. ”Evolutionär bevarande av kodonoptimalitet avslöjar dolda signaturer av cotranslationell vikning.”Naturstruktur & molekylär biologi20. 2 (2013): 237. PubMed PMID: 23262490. PubMed centrala PMCID: PMC3565066.
7. Quax, Tessa EF, et al. ”Kodonbias som ett sätt att finjustera genuttryck.”Molekylär cell 59.2 (2015): 149-161. PubMed PMID: 26186290. PubMed centrala PMCID: PMC4794256.
- denna recension ger en bra översikt över kodonanvändningsförspänning
8. Tuller, Tamir, et al. ”Översättningseffektivitet bestäms av både kodonförspänning och vikningsenergi.”Proceedings of the National Academy of Sciences 107.8 (2010): 3645-3650. PubMed PMID: 20133581. PubMed centrala PMCID: PMC2840511.