Klassiskt, för att utföra en radioimmunoassay, görs en känd mängd av ett antigen radioaktivt, ofta genom att märka det med gamma-radioaktiva isotoper av jod, såsom 125-I, fäst vid tyrosin. Detta radiomärkta antigen blandas sedan med en känd mängd antikropp för det antigenet, och som ett resultat binder de två specifikt till varandra. Därefter tillsätts ett prov av serum från en patient som innehåller en okänd mängd av samma antigen. Detta gör att det omärkta (eller” kalla”) antigenet från serumet konkurrerar med det radiomärkta antigenet (”hett”) för antikroppsbindningsställen. När koncentrationen av” kallt ” antigen ökas, binder mer av det till antikroppen, förskjuter den radiomärkta varianten och reducerar förhållandet mellan antikroppsbundet radiomärkta antigen till fritt radiomärkta antigen. De bundna antigenerna separeras sedan och radioaktiviteten hos det fria(obundna) antigenet som finns kvar i supernatanten mäts med hjälp av en gamma-räknare.
denna metod kan i princip användas för vilken biologisk molekyl som helst och är inte begränsad till serumantigener, och det är inte heller nödvändigt att använda den indirekta metoden för att mäta det fria antigenet istället för att direkt mäta det fångade antigenet. Till exempel, om det är oönskat eller inte möjligt att radiomärka antigenet eller målmolekylen av intresse, kan en RIA göras om två olika antikroppar som känner igen målet är tillgängliga och målet är tillräckligt stort (t.ex. ett protein) för att presentera flera epitoper till antikropparna. En antikropp skulle radiomärkas som ovan medan den andra skulle förbli omodifierad. RIA skulle börja med att den” kalla ” omärkta antikroppen får interagera och binda till målmolekylen i lösning. Företrädesvis immobiliseras denna omärkta antikropp på något sätt, såsom kopplad till en agarospärla, belagd på en yta etc. Därefter tillåts den” heta ” radiomärkta antikroppen att interagera med det första antikroppsmålmolekylkomplexet. Efter omfattande tvättning mäts den direkta mängden radioaktiv antikroppsbunden och mängden målmolekyl kvantifieras genom att jämföra den med ett referensmängd som analyseras samtidigt. Denna metod liknar i princip den icke-radioaktiva sandwich ELISA-metoden.