1 Introduktion
gener för transmembranproteiner (tmp) utgör 20-30% av de flesta genom (Wallin & Heijne, 1998), och baserat på deras kritiska roller i cellfysiologi, tmp är målen för en stor del av kliniskt användbara läkemedel. Således är bestämning av deras strukturer och handlingssätt av stor betydelse. Antalet tillgängliga tmp-strukturer med hög upplösning förblir dock relativt lågt (se webbsida för Stephen White; http://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/). Två förklaringar som ofta åberopas för svårigheten att erhålla väldiffraktionskristaller av tmp för användning i Röntgendiffraktionsstudier är (1) tmp: er är strukturellt dynamiska med flexibla regioner som gör det svårt för proteinet att anta den enhetliga konformation som krävs för packning i en kristall; och (2) ytor av transmembranregioner av TMP: er deltar inte lika lätt som ytorna på globulära lösliga proteiner i protein–proteininteraktioner som krävs för kristallförpackning. Att införa ett stabilt lösligt protein i en ytaxponerad region av en TMP ger ett sätt att potentiellt kringgå båda dessa problem, eftersom en sådan insättning vid en intern plats i en TMP kan minska den totala flexibiliteten och eftersom närvaron av en lättkristalliserbar löslig domän kan ge intermolekylära kontakter som krävs för kristallisering (Chun et al., 2012; Engel, Chen, & Privabgbg, 2002).
Fusion av T4-lysozym (T4L) på interna platser i TMPs har hittills gett ett framgångsrikt tillvägagångssätt för bestämning av strukturerna hos olika medlemmar i den viktiga GPCR-superfamiljen (Cherezov et al., 2007; Chien et al., 2010; Dore et al., 2014; Fenalti et al., 2014; Granier et al., 2012; Haga et al., 2012; Hanson et al., 2012; Hollenstein et al., 2013; Jaakola et al., 2008; Kruse et al., 2012; Manglik et al., 2012; Rosenbaum et al., 2007, 2011; Shimamura et al., 2011; Tan et al., 2013; Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; vit et al., 2012; Wu et al., 2010, 2012; Xu et al., 2011; Zhang et al., 2012). Liknande interna fusioner av en termiskt stabiliserad apocytokrom b (Wacker et al., 2013; Wang et al., 2013; Zhang, Zhang, Gao, Paoletta et al., 2014; Zhang, Zhang, Gao, Zhang, et al., 2014) och rubredoxin (Tan et al., 2013) har också gett GPCR-strukturer. Dessutom har flera GPCR-strukturer erhållits genom kristallisering av konstruktioner i vilka den stabiliserande proteinpartnern smältes vid n-änden av receptorsekvensen, snarare än vid en intern position (Fenalti et al., 2014; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Siu et al., 2013; Thompson et al., 2012; Wu et al., 2014), vilket tyder på att fusionsproteinernas roll vid underlättande av bildning av intermolekylära kontakter kan vara viktigare för att främja kristallisering än minskningen av TMP-flexibilitet. Alternativa tillvägagångssätt för att erhålla GPCR-strukturer som inte involverar användning av fusionsproteiner har inkluderat kokristallisering med anti-receptorantikroppar (Kruse et al., 2013; Rasmussen, Choi, et al., 2011; Rasmussen et al., 2007; Rasmussen, DeVree, et al., 2011; Ring et al., 2013) och kristalliseringen av GPCR-varianter som har termostabiliserats genom införandet av punktmutationer och deletioner (Egloff et al., 2014; Scott, Kummer, Tremmel, & Pluckthun, 2013; Tate, 2012). Faktum är att de flesta fusionsproteininnehållande GPCR-varianter som används för framgångsrik strukturbestämning också har införlivat punktmutationer och stympningar utformade för att ytterligare förbättra proteinstabiliteten och minska flexibiliteten.
införande av stabila lösliga proteiner i tmp för att främja kristallisering har i allmänhet utförts som en insättning eller ersättning för rester i den tredje intracellulära (IC3) slingan av GPCRs. Detta är baserat på förväntan att denna region i receptorer är flexibel och kan styra den relativa rörelsen hos omgivande helixer (Rosenbaum et al., 2007), samt att minska sannolikheten för att införandet av fusionspartnern kommer att störa den övergripande GPCR-strukturen (Chun et al., 2012). Medan sådana Infogningar ofta inte stör receptorns övergripande strukturer (baserat på retention av åtminstone någon ligandbindningsaffinitet genom fusionskonstruktionerna), resulterar de i allmänhet i förlust av förmågan att aktivera det kognata trimera G-proteinet (Rosenbaum et al., 2007), vilket inte är förvånande eftersom IC3-slingan ofta är platsen för funktionella interaktioner mellan GPCRs och de trimera G-proteinerna som är deras omedelbara nedströmseffektorer. Vidare är kriterierna för att fastställa särskilda korsningsställen för införande av fusionsproteiner och för att bestämma mängden receptorsekvens som de ersätter inte väl etablerade. En framgångsrik fusion måste ge en optimal matchning mellan Avståndet och orienteringen av N – och C-termini av det infogade proteinet och korsningsställena i GPCR (Chun et al., 2012; Engel et al., 2002). Således kan skapandet av en användbar fusion kräva syntes eller konstruktion av flera versioner av smälta gener (Rosenbaum et al., 2007).
vi beskriver här en strategi för att generera och screena ett bibliotek med variantformer av en receptor innehållande Infogningar av T4L vid olika punkter i den tredje intracellulära (IC3) slingan som ersättning för olika antal aminosyrarester i slingsekvensen (Mathew, Ding, Naider, & Dumont, 2013). Genom att uttrycka receptorer i jäst är det möjligt att skapa randomiserade bibliotek av varianter med lysozyminsättningar och att direkt screena för konstruktioner med maximala övergripande uttrycksnivåer, antal ligandbindningsställen vid cellytan och till och med receptorfunktion, analyserad baserat på aktivering av det kognata G-proteinet. Tillvägagångssätten var framgångsrika i att identifiera receptorer med Infogningar i IC3-slingan som behåller nästan full signalfunktion. Detta antyder att, när den fästs via lämpliga länkningssekvenser, kan T4L-molekylen införas i denna slinga utan att förhindra åtkomst av G-proteinet till relevanta ytor hos den aktiverade receptorn.
de beskrivna protokollen utvecklades med användning av Ste2p, en endogen GPCR av jästen Saccharomyces cerevisiae som används som ett lätthanterligt initialt system för vilket ingen tredimensionell struktur ännu är tillgänglig. Likartade tillvägagångssätt kan emellertid användas för att identifiera införingsinnehållande varianter av de många däggdjursgpcr: erna som har rapporterats kunna aktivera jästferomonresponsvägen (Brown et al., 2000; Dowell & Brown, 2009; King, Dohlman, Thorner, Caron, & Lefkowitz, 1990; Pausch, 1997), eller till andra tmp: er för vilka det är möjligt att analysera för funktion i intakta celler. Dessutom har jästarter använts som uttryckssystem för strukturbestämning av GPCR och andra tmp (Clark et al., 2010), inklusive för bestämning av kristallstrukturen hos den humana H1-histaminreceptorn (Shimamura et al., 2011; Shiroishi et al., 2011). Ste2p är receptorn för jästparande feromon, en 13-restpeptid. Bindning av denna ligand resulterar i aktivering av ett cytoplasmiskt heterotrimeriskt g-protein, vilket i sin tur aktiverar en MAP-kinasväg, vilket i slutändan leder till transkriptionssvar, förändringar i cellform, cellcykelstopp och fusion med jästceller av motsatt parningstyp.