2-D elektrofores börjar med elektrofores i den första dimensionen och separerar sedan molekylerna vinkelrätt från den första för att skapa ett elektroferogram i den andra dimensionen. Vid elektrofores i den första dimensionen separeras molekyler linjärt enligt deras isoelektriska punkt. I den andra dimensionen separeras sedan molekylerna vid 90 grader från det första elektroferogrammet enligt molekylmassa. Eftersom det är osannolikt att två molekyler kommer att likna i två distinkta egenskaper, separeras molekyler mer effektivt i 2-D-elektrofores än i 1-d-elektrofores.
de två dimensionerna som proteiner separeras i med hjälp av denna teknik kan vara isoelektrisk punkt, proteinkomplexmassa i nativt tillstånd eller proteinmassa.
Separation av proteinerna med isoelektrisk punkt kallas isoelektrisk fokusering (IEF). Därigenom appliceras en pH-gradient på en gel och en elektrisk potential appliceras över gelen, vilket gör den ena änden mer positiv än den andra. Vid alla andra pH-värden än deras isoelektriska punkt kommer proteiner att laddas. Om de är positivt laddade kommer de att dras mot den mer negativa änden av gelen och om de är negativt laddade kommer de att dras till den mer positiva änden av gelen. Proteinerna som appliceras i den första dimensionen kommer att röra sig längs gelen och ackumuleras vid deras isoelektriska punkt; det vill säga den punkt vid vilken den totala laddningen på proteinet är 0 (en neutral laddning).
för analys av proteinernas funktion i en cell är kunskapen om deras samarbete avgörande. Oftast verkar proteiner tillsammans i komplex för att vara fullt funktionella. Analysen av denna suborganellorganisation av cellen kräver tekniker som bevarar proteinkomplexens nativa tillstånd. I nativ polyakrylamidgelelektrofores (native PAGE) förblir proteiner i sitt ursprungliga tillstånd och separeras i det elektriska fältet efter deras massa respektive massan av deras komplex. För att erhålla en separation efter storlek och inte genom nettoladdning, som i IEF, överförs en extra laddning till proteinerna genom användning av Coomassie Brilliant Blue eller litiumdodecylsulfat. Efter fullbordandet av den första dimensionen förstörs komplexen genom att applicera DENATURERANDE SDS-sidan i den andra dimensionen, där proteinerna som komplexen består av separeras av deras massa.
innan proteinerna separeras i massa behandlas de med natriumdodecylsulfat (SDS) tillsammans med andra reagens (SDS-sida i 1-D). Detta denaturerar proteinerna (det vill säga det utvecklar dem till långa, raka molekyler) och binder ett antal SDS-molekyler ungefär proportionella mot proteinets längd. Eftersom ett protein längd (när ovikt) är ungefär proportionell mot dess massa, motsvarar detta att säga att det fäster ett antal SDS molekyler ungefär proportionell mot proteinets massa. Eftersom SDS-molekylerna är negativt laddade är resultatet av detta att alla proteiner kommer att ha ungefär samma massa-till-laddningsförhållande som varandra. Dessutom kommer proteiner inte att migrera när de inte har någon laddning (ett resultat av det isoelektriska fokuseringssteget), Därför tillåter beläggningen av proteinet i SDS (negativt laddat) migrering av proteinerna i den andra dimensionen (SDS-PAGE, det är inte kompatibelt för användning i den första dimensionen eftersom det laddas och ett nonjoniskt eller zwitterioniskt tvättmedel måste användas).i den andra dimensionen appliceras en elektrisk potential igen, men i 90 graders vinkel från det första fältet. Proteinerna kommer att lockas till den mer positiva sidan av gelen (eftersom SDS är negativt laddad) proportionellt mot deras mass-till-laddningsförhållande. Som tidigare förklarats kommer detta förhållande att vara nästan detsamma för alla proteiner. Proteins framsteg kommer att bromsas av friktionskrafter. Gelen fungerar därför som en molekylsikt när strömmen appliceras, separerar proteinerna på grundval av deras molekylvikt med större proteiner kvarhållna högre i gelen och mindre proteiner kan passera genom sikten och nå lägre områden av gelen.