In this blog post, the differences between molecular absorption, excitation and emission spectra are explained.
Absorption Spectra
Figure 1: Absorption spectrum of anthracene in cyclohexane measured using the FS5 Spectrofluorometer. Experimental parameters: Δλ = 1 nm.
Gli spettri di assorbimento (noti anche come spettri UV-Vis, spettri di assorbanza e spettri elettronici) mostrano la variazione dell’assorbanza di un campione in funzione della lunghezza d’onda della luce incidente (Figura 1) e sono misurati utilizzando uno spettrofotometro. Gli spettri di assorbimento sono misurati variando la lunghezza d’onda della luce incidente usando un monocromatore e registrando l’intensità della luce trasmessa su un rivelatore. L’intensità della luce trasmessa attraverso il campione, ISample, (come un analita disciolto in solvente) e l’intensità della luce che attraversa un vuoto, IBlank, (solvente) sono registrati e l’assorbanza del campione calcolato utilizzando:
L’assorbanza è linearmente proporzionale alla concentrazione molare del campione; che consente la concentrazione del campione per essere calcolato lo spettro di assorbimento utilizzando la Legge di Beer-Lambert.
Figura 2: Schema della misura degli spettri di assorbimento in uno spettrofotometro.
Spettri di eccitazione
Figura 3: Spettro di eccitazione della fluorescenza dell’antracene nel cicloesano misurato utilizzando lo spettrofluorometro FS5. Parametri sperimentali: λem = 420 nm, Δλem = 1 nm, Δλex = 1 nm.
Gli spettri di eccitazione a fluorescenza mostrano la variazione dell’intensità della fluorescenza in funzione della lunghezza d’onda della luce di eccitazione (Figura 3) e vengono misurati utilizzando uno spettrofluorometro. La lunghezza d’onda del monocromatore di emissione è impostata su una lunghezza d’onda di emissione di fluorescenza nota dal campione e la lunghezza d’onda del monocromatore di eccitazione viene scansionata attraverso l’intervallo di eccitazione desiderato e l’intensità della fluorescenza registrata sul rivelatore in funzione della lunghezza d’onda di eccitazione. Se il campione obbedisce alla regola di Kasha e alla regola di Vavilov, lo spettro di eccitazione e lo spettro di assorbimento saranno identici (confronta le figure 1 e 3). Gli spettri di eccitazione possono quindi essere considerati come spettri di assorbimento rilevati in fluorescenza.
Figure 4: Schematic of the measurement of excitation spectra in a spectrofluorometer.
Emission Spectra
Figure 5: Fluorescence emission spectrum of anthracene in cyclohexane measured using the FS5 Spectrofluorometer. Experimental parameters: λex = 340 nm, Δλex = 1nm, Δλem= 1 nm
Gli spettri di emissione di fluorescenza mostrano la variazione dell’intensità della fluorescenza in funzione della lunghezza d’onda della luce di emissione (Figura 5) e sono misurati utilizzando uno spettrofluorometro. La lunghezza d’onda del monocromatore di eccitazione è impostata su una lunghezza d’onda di assorbimento noto dal campione e la lunghezza d’onda del monocromatore di emissione viene scansionata attraverso l’intervallo di emissione desiderato e l’intensità della fluorescenza registrata sul rivelatore in funzione della lunghezza d’onda di emissione.
Figura 6: Schema della misura degli spettri di emissione in uno spettrofluorometro.
Per saperne di più
Per ulteriori informazioni sulla teoria dell’assorbimento e della spettroscopia di fluorescenza, consulta la sezione domande frequenti sul nostro blog.
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