Worum geht es in der Metabolomik?

Was ist Metabolomik?

Das sich rasch entwickelnde Gebiet der Metabolomik kombiniert Strategien zur Identifizierung und Quantifizierung zellulärer Metaboliten unter Verwendung ausgefeilter Analysetechnologien mit der Anwendung statistischer und variantenreicher Methoden zur Informationsextraktion und Dateninterpretation. In den letzten zwei Jahrzehnten wurden enorme Fortschritte bei der Sequenzierung einer Reihe verschiedener Organismen erzielt. Gleichzeitig wurden große Investitionen getätigt, um analytische Ansätze zur Analyse der verschiedenen Zellprodukte zu entwickeln, beispielsweise aus Genexpression (Transkripten), Proteinen und Metaboliten. Alle diese sogenannten Omics-Ansätze, einschließlich Genomik, Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik, gelten als wichtige Werkzeuge, die angewendet und genutzt werden müssen, um die Biologie eines Organismus und seine Reaktion auf Umweltreize oder genetische Störungen zu verstehen.

Metaboliten gelten als „gesprochene Sprache, die Signale aus der genetischen Architektur und der Umwelt sendet“ (1), und daher wird die Metabolomik als direkte „funktionelle Anzeige des physiologischen Zustands“ eines Organismus angesehen (2). Eine Reihe von Analysetechnologien wurde eingesetzt, um Metaboliten in verschiedenen Organismen, Geweben oder Flüssigkeiten zu analysieren (zur Übersicht siehe Referenz 3). Massenspektrometrie gekoppelt mit verschiedenen chromatographischen Trenntechniken, wie Flüssigkeits- oder Gaschromatographie oder NMR, sind die wichtigsten Werkzeuge, um eine große Anzahl von Metaboliten gleichzeitig zu analysieren. Obwohl die Technologie hochentwickelt und sensibel ist, gibt es immer noch einige Engpässe in der Metabolomik. Aufgrund der großen Vielfalt chemischer Strukturen und der großen Unterschiede in der Häufigkeit steht keine einzige Technologie zur Verfügung, um das gesamte Metabolom zu analysieren. Daher müssen eine Reihe komplementärer Ansätze für die Extraktion, den Nachweis, die Quantifizierung und die Identifizierung möglichst vieler Metaboliten entwickelt werden (3,4).

Eine weitere Herausforderung in der Metabolomik besteht darin, aus den riesigen Datenmengen, die von Hochdurchsatzanalysatoren erzeugt werden, die Informationen zu extrahieren und in einem biologischen Kontext zu interpretieren. Die Anwendung ausgefeilter statistischer und variantenreicher Datenanalysewerkzeuge, einschließlich Clusteranalyse, Pathway-Mapping, vergleichende Überlagerungen, und Heatmaps, war nicht nur ein aufregender und steiler Lernprozess für Biochemiker, hat aber auch gezeigt, dass sich das derzeitige Denken ändern muss, um mit großen Datensätzen umzugehen und zwischen Rauschen und realen probenbezogenen Informationen zu unterscheiden. Darüber hinaus und immer noch ohne Konsens in der Metabolomics-Community stellt sich die Frage: „Wie gehen wir mit Daten um, die auf der Grundlage von Literatur und allgemeinem Wissen biologisch keinen Sinn ergeben?“ Wir fangen erst an zu vermuten, wohin uns die Metabolomik zusammen mit den anderen Omics-Technologien führen wird: Werden wir mehr Antworten auf unsere Fragen finden oder wird sie mehr Fragen bringen, die mehr Antworten erfordern?

Potenzial und Anwendungen der Metabolomik

In der Metabolomik gibt es vier konzeptionelle Ansätze: Zielanalyse, Metabolitenprofilierung, Metabolomik und metabolisches Fingerprinting (5). Die Zielanalyse wird seit vielen Jahrzehnten angewendet und umfasst die Bestimmung und Quantifizierung eines kleinen Satzes bekannter Metaboliten (Targets) unter Verwendung einer bestimmten Analysetechnik mit der besten Leistung für die interessierenden Verbindungen. Metabolite Profiling, auf der anderen Seite, zielt auf die Analyse einer größeren Menge von Verbindungen, sowohl identifiziert als auch unbekannt in Bezug auf ihre chemische Natur. Dieser Ansatz wurde für viele verschiedene biologische Systeme unter Verwendung von GC-MS angewendet, einschließlich Pflanzen (6), Mikroben (7), Urin (8) und Plasmaproben (9). Die Metabolomik verwendet komplementäre Analysemethoden, beispielsweise LC-MS / MS, GC-MS und / oder NMR, um so viele Metaboliten wie möglich zu bestimmen und zu quantifizieren, entweder identifizierte oder unbekannte Verbindungen. Der vierte konzeptionelle Ansatz ist der metabolische Fingerabdruck (oder Fußabdruck für externe und / oder sekretierte Metaboliten). Hier wird eine metabolische „Signatur“ oder ein Massenprofil der interessierenden Stichprobe generiert und dann in einer großen Stichprobenpopulation verglichen, um nach Unterschieden zwischen den Stichproben zu suchen. Wenn Signale nachgewiesen werden, die zwischen Proben signifikant unterscheiden können, werden die Metaboliten identifiziert und die biologische Relevanz dieser Verbindung kann aufgeklärt werden, wodurch die Analysezeit erheblich verkürzt wird.

Da Metaboliten so eng mit dem Phänotyp eines Organismus verbunden sind, kann die Metabolomik für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, einschließlich der Phänotypisierung gentechnisch veränderter Pflanzen und erheblicher Äquivalenztests, der Bestimmung der Genfunktion und der Überwachung von Reaktionen auf biotischen und abiotischen Stress. Die Metabolomik kann daher als Überbrückung der Lücke zwischen Genotyp und Phänotyp angesehen werden (5), die einen umfassenderen Überblick über die Funktionsweise von Zellen bietet und neuartige oder auffällige Veränderungen bestimmter Metaboliten identifiziert. Die Analyse und das Data Mining von metabolomischen Datensätzen und deren Metadaten können auch zu neuen Hypothesen und neuen Zielen für die Biotechnologie führen.

Metabolomik und Evolution

Bis heute basiert die meiste Evolutionsforschung auf der Konstruktion phylogenetischer Bäume von Arten unter Verwendung von Sequenzen von Genomen, Genen, mRNA und / oder Proteinen. Die Korrelation von Gen- und Proteinexpression ist jedoch gering und die zwischen Genexpression und Metaboliten noch geringer. Metaboliten, insbesondere Sekundärmetaboliten, sind jedoch für die meisten Organismen äußerst wichtig, um sich gegen stressige Umgebungen oder Raubtiere zu verteidigen. Obwohl primäre Metaboliten, die am zentralen Metabolismus beteiligt sind, zur Bestimmung des Ernährungs- und Wachstumsstatus verwendet werden können, können sekundäre Metabolitenprofile die Differenzierung von Arten und ihre komplexe Reaktion auf Umweltfaktoren und andere Organismen besser widerspiegeln. Die Suite von Sekundärmetaboliten in einem Organismus kann erstaunlich komplex sein, und während bestimmte Verbindungen in verschiedenen Organismen gefunden werden können, sind eine große Anzahl von Verbindungen sehr artenspezifisch. Sekundärmetaboliten werden daher als potenzielle Marker für die Taxonomie und Phylogenetik angesehen (10).

Die wahrscheinlich besten und aufregendsten Anwendungen von Metabolomik-Tools zur Unterscheidung verschiedener Pilzarten wurden von Smedsgaard und Nielsen zusammengefasst (11). Die Direktinfusions-Elektrospray-Massenspektrometrie (DiMS) wurde zur schnellen chemischen Klassifizierung von filamentösen Pilzen verwendet. Rohe Pilzextrakte verschiedener Unterarten wurden direkt in ein Massenspektrometer injiziert und die resultierenden Massenprofile mit chemometrischen Analysewerkzeugen verglichen (4). Mehr als 80% der analysierten Arten konnten anhand ihres Massenprofils im Vergleich zu einer herkömmlichen phänotypischen Identifizierung klassifiziert werden.

In unserem Labor untersuchen wir mithilfe der Metabolomik neuartige Mechanismen zur Anpassung und Toleranz von Pflanzen an abiotische Belastungen wie Trockenheit, Salzgehalt, Kälte, Frost und Mineralstoffmangel oder Toxizitäten.www.acpfg.com.au). Unsere wichtigsten Pflanzen von Interesse sind Getreide, wie Gerste und Weizen, aber wir betrachten auch Modellpflanzen oder Pflanzen, von denen bekannt ist, dass sie eine höhere Toleranz gegenüber einem bestimmten Stresszustand aufweisen. Der Vergleich der Reaktionen verschiedener Arten auf verschiedene Belastungen zeigte, dass es eine Reihe von Reaktionen gibt, die stress- und / oder pflanzenspezifisch sind, und einige, die zwischen Stress und / oder Pflanzen gemeinsam sind. Daher haben wir beschlossen, die Metaboliten in den Blättern von vier verschiedenen Arten zu vergleichen: das Moos Physcomitrella patens, die Modellpflanze Arabidopsis thaliana und die Kulturpflanzen Hordeum vulgare L. und Triticum aestivum L. Wir haben die Metabolitenspiegel in unbelasteten Pflanzen verglichen, um zu untersuchen, ob ein Zusammenhang zwischen Toleranzwerten und Metabolitenprofilen besteht. Wir verwendeten GC-MS, um ∼140 bekannte Metaboliten (12) zu profilieren und die Daten für den Vergleich zwischen den Spezies zu normalisieren. Die multivariate Analyse des resultierenden Datensatzes unter Verwendung einer prinzipiellen Komponenten- oder hierarchischen Clusteranalyse zeigte, dass die Metabolitenprofile der vier Arten sehr unterschiedlich sind, wobei die Gersten- und Weizenblattprofile am ähnlichsten sind (Abbildung 1A). Die erste Hauptkomponente trennte Weizen und Gerste von den beiden anderen Arten und machte 58% der Variabilität des gesamten Datensatzes aus. Abbildung 1B zeigt eine Heatmap-Darstellung desselben Datensatzes, in der die Metaboliten der verschiedenen Spezies verglichen werden. Die meisten Metaboliten sind in Moos und Arabidopsis im Vergleich zu Gerste und Weizen viel niedriger (Rohdaten nicht dargestellt). Es gibt einige Ausnahmen, einschließlich Harnstoff, Glycerin, Tyramin, Allantoin, Tocopherol, Xylit, Fucose und Inositol.gefunden auf viel höheren Ebenen im Moos als in allen anderen Arten. Dies wirft die Frage auf, ob diese Metaboliten für die hohe Toleranz von Moos gegenüber abiotischen Belastungen verantwortlich sein können (13).

Dieses Beispiel zeigt das Potenzial der Metabolomik zur Identifizierung und Klassifizierung von Organismen. Die oben genannten Beispiele können nur der Anfang sein. Wir halten es für sinnvoll, eine systematischere Studie durchzuführen, um Metabolitenprofile zwischen einer größeren Anzahl von Organismen unter Verwendung komplementärer analytischer Ansätze zu vergleichen, um so viele Metaboliten wie möglich abzudecken, und zu untersuchen, ob die Metabolitenprofile mit phylogenetischen und evolutionären Beziehungen zwischen Organismen zusammenhängen. Diese Art von Studie kann zu neuen Einsichten in die Entwicklung von Signalwegen, Überlebensmechanismen und Leben im Allgemeinen führen.

Metabolomics in a systems biology context

Wie wir in dieser Arbeit beschrieben haben, zielt Metabolomics idealerweise auf die Analyse aller kleinen Moleküle in einer Zelle ab. Dies ist nur ein Teil der zellulären Produkte innerhalb einer Zelle. Für einen systembiologischen Ansatz bietet die Metabolomik nur die Messung eines Teils aller Elemente in einem biologischen System. Die Systembiologie umfasst jedoch nicht nur die Fähigkeit, alle Elemente eines Systems wie DNA, mRNA, Proteine, Metaboliten und Strukturelemente wie Zellwände und Membranen zu messen, sondern auch die Beziehung dieser Elemente zueinander als Teil des Systems zu bestimmen Reaktion auf umweltbedingte oder genetische Störungen. Nach der Integration aller verschiedenen Informationsebenen soll das Verhalten des Systems mithilfe von Rechenmethoden modelliert werden, mit denen das Verhalten des Systems unter jeder Art von Störung beschrieben werden kann. Ein systembiologischer Ansatz erfordert, dass Biologen, Physiker, Informatiker, Ingenieure, Chemiker und Mathematiker eine gemeinsame Sprache lernen, die es ihnen ermöglicht, miteinander zu kommunizieren. Eine weitere wichtige Voraussetzung für einen erfolgreichen systembiologischen Ansatz ist die Schaffung einer Umgebung, die Zugang zu allen Hochdurchsatzplattformen bietet, die benötigt werden, um die Eigenschaften und Elemente des interessierenden Systems zu erhalten und zu messen. Darüber hinaus muss ein effektiver systembiologischer Ansatz die Möglichkeit und den Umfang für die schnelle Entwicklung und den Einsatz neuer globaler Technologien und leistungsfähiger Rechenwerkzeuge bieten, die das Sammeln, Klassifizieren, Analysieren, Integrieren und letztendlich die Modellierung biologischer Informationen ermöglichen.

Systemansätze für menschliche Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Fettleibigkeit werden die Möglichkeit bieten, den Erfolg der Auswahl eines neuartigen Ziels für Behandlungen und die Arzneimittelentwicklung erheblich zu erleichtern. Die Systembiologie könnte es uns in Zukunft ermöglichen, neue Ansätze in der Medizin zu entwickeln, die prädiktiv, präventiv und personalisiert sind. Ziel wäre es, die Fähigkeit zu erreichen, eine probabilistische Gesundheitsgeschichte für jeden Einzelnen zu bestimmen, und in diesem Rahmen wird die Systembiologie eine Strategie für die Entdeckung und Entwicklung neuer therapeutischer und präventiver Medikamente sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Untersuchung der Reaktion verschiedener Organismen auf unterschiedliche Belastungen und Umgebungen auf genetischer, Transkript-, Protein- und Metabolitenebene mit verschiedenen Methoden und der Vergleich dieser Ergebnisse mit denen anderer Organismen ihre Integration in einen systembiologischen Rahmen stärken wird. Wenn sich der Rahmen entwickelt, wird die größere Synergie zwischen Organismen ein viel klareres Bild der Funktion von Zellen, Organen und Organismen liefern und uns dem Verständnis ihrer Rolle in der Natur näher bringen.