Několik variant základní technika může být použita v závislosti na tom, co výzkumník chce studovat. Techniky dovnitř a ven se nazývají techniky „vyříznuté náplasti“, protože náplast je vyříznuta (odstraněna) z hlavního těla buňky. Pro studium chování jednotlivých iontových kanálů v části membrány připojené k elektrodě se používají techniky připojené k buňkám a obě vyříznuté náplasti.
celobuněčná náplast a perforovaná náplast umožňují výzkumníkovi studovat elektrické chování celé buňky namísto jednokanálových proudů. Celý-cell patch, který umožňuje low-odpor elektrických přístup do vnitřku buňky, má nyní z velké části nahrazeny high-odpor záznam mikroelektroda techniky pro záznam proudů v celé buněčné membrány.
Cell-attached patchEdit
Pro tuto metodu, pipety je uzavřena na buněčné membrány k získání gigaseal, a zároveň zajistit, že buněčná membrána zůstává intaktní. To umožňuje záznam proudů prostřednictvím jednoho nebo několika iontových kanálů obsažených v náplasti membrány zachycené pipetou. Pouze připojení k vnější buněčné membráně, tam je velmi malé narušení buněčné struktury. Také, tím, že narušuje vnitřní buňky, nějaké intracelulární mechanismy, které se normálně ovlivňující kanál bude stále schopen fungovat, jak by fyziologicky. Pomocí této metody je také relativně snadné získat správnou konfiguraci a po získání je poměrně stabilní.
u ligandem řízených iontových kanálů nebo kanálů, které jsou modulovány metabotropními receptory, je studovaný neurotransmiter nebo léčivo obvykle zahrnuto do roztoku pipety, kde může interagovat s tím, co bývalo vnějším povrchem membrány. Výsledná aktivita kanálu může být přičítána použitému léčivu, i když obvykle není možné změnit koncentraci léčiva uvnitř pipety. Tato technika je tedy omezena na jeden bod v křivce odpovědi na dávku na náplast. Odpověď na dávku se proto provádí pomocí několika buněk a náplastí. Napěťově řízené iontové kanály však mohou být upnuty postupně na různých membránových potenciálech v jedné náplasti. Výsledkem je aktivace kanálu jako funkce napětí a úplná křivka I-V (proud-napětí) může být vytvořena pouze v jedné opravě. Další potenciální nevýhodou této techniky je to, že stejně jako intracelulární dráhy buňky nejsou narušeny,nemohou být přímo modifikovány.
Uvnitř-out patchEdit
V inside-out metoda, opravu membrány je připojen k patch pipety, oddělený od zbytku buňky, a cytosolickou povrch membrány je vystaven na externí médium, nebo vana. Jednou z výhod této metody je, že experimentátor má přístup k intracelulárním povrchu membrány prostřednictvím vana a může změnit chemické složení, co se na povrchu membrány je vystavena. To je užitečné, když si experimentátor přeje manipulovat s prostředím na intracelulárním povrchu jednotlivých iontových kanálů. Například kanály, které jsou aktivovány intracelulárními ligandy, mohou být studovány prostřednictvím rozsahu koncentrací ligandu.
K dosažení uvnitř-out konfigurace, pipety je připojené k buněčné membráně jako v buňce-připojené režimu, které tvoří gigaseal, a je tak zatažen do ulomit kousek membrány od zbytku buňky. Vytažení membrány náplasti často vede zpočátku při tvorbě váčků z membrány ve špičce pipety, protože končí náplasti membrána spojí se rychle po vyříznutí. Vnější povrch vezikuly musí být poté rozbit, aby se dostal do režimu naruby; to může být provedeno tím, že krátce přičemž membrány prostřednictvím vana roztok/vzduch rozhraní, vystavením nízké Ca2+ roztoku, nebo tím, že na okamžik kontakt s kapky parafínu nebo kus vytvrzeného silikonového polymeru.
Whole-cell pro záznam nebo celých buněk patchEdit
Whole-cell záznamů zahrnují záznam proudů několika kanálů současně, přes velké oblasti buněčné membrány. Elektroda je ponechána na místě na buňku, jako v buňce-přiložené nahrávky, ale sání je použita k prasknutí membrány náplasti, a poskytuje tak přístup z vnitřku pipety do intracelulárního prostoru buňky. To poskytuje prostředky pro správu a studium toho, jak léčba (např. léky) může ovlivnit buňky v reálném čase. Jakmile je pipeta připojena k buněčné membráně, existují dva způsoby rozbití náplasti. Prvním je použití většího sání. Množství a trvání tohoto sání závisí na typu buňky a velikosti pipety. Druhá metoda vyžaduje, aby byl pipetou odeslán velký proudový puls. Kolik proudu je aplikováno a trvání pulzu závisí také na typu buňky. U některých typů buněk je vhodné použít obě metody současně k přerušení náplasti.
výhodou celek-cell patch clamp nahrávání přes ostré elektroda technika nahrávání je, že větší otvor na špičce patch clamp elektroda poskytuje nižší odpor a tedy lepší přístup k elektrické uvnitř buňky. Nevýhodou této techniky je, že protože objem elektrody je větší než objem buněk, rozpustné obsah buňky je interiér bude pomalu nahrazuje obsah elektrody. Toto se označuje jako elektroda „dialyzující“ obsah buňky. Po chvíli se změní všechny vlastnosti buňky, které závisí na rozpustném intracelulárním obsahu. Použitý roztok pipety obvykle přibližuje prostředí s vysokým obsahem draslíku ve vnitřku buňky, aby se minimalizovaly jakékoli změny, které to může způsobit. Na začátku záznamu celé buňky je často období, kdy lze provést měření před dialyzací buňky.
patcheditovat
název „outside-out“ zdůrazňuje, jak tato technika je komplementarita uvnitř-out technikou, a skutečnost, že místa na vnější, spíše než intracelulární povrchu buněčné membrány na vnější náplast membrány, ve vztahu k patch elektrody.
tvorba náplasti mimo výstup začíná konfigurací záznamu celé buňky. Po whole-cell konfigurace je vytvořena, elektrody se pomalu stažen z buňky, což umožňuje žárovka membrány na puchýřek ven z buňky. Když se elektroda vytáhl dost daleko, to puchýřek se odpoutat od buňky a reforma jako konvexní membrána na konci elektrody (jako míč, otevřít na hrot elektrody), s původní vnější membrány směrem ven z elektrody. Jak ukazuje obrázek vpravo, znamená to, že tekutina uvnitř pipety bude simulovat intracelulární tekutinu, zatímco výzkumník může volně pohybovat pipetou a bleb svými kanály do jiné Lázně roztoku. Zatímco v blebu membrány může existovat více kanálů, v této konformaci jsou také možné jednokanálové záznamy, pokud je bleb oddělené membrány malý a obsahuje pouze jeden kanál.
Mimo-out záplatování dává experimentátor možnost zkoumat vlastnosti iontového kanálu, když je izolovaný z buněčné a vystaven postupně na různá řešení na extracelulární povrch membrány. Experimentátor může prokrvení stejný patch s řadou řešení v relativně krátkém čase, a v případě, že kanál je aktivován neurotransmiter, nebo lék z extracelulární tvář, křivky dávka-odezva pak mohou být získány. Tato schopnost měřit proud přes přesně stejný kus membrány v různých řešeních je zřetelnou výhodou vnější-out náplasti vzhledem k metodě připojené k buňce. Na druhou stranu je obtížnější dosáhnout. Delší proces tvorby zahrnuje více kroků, které by mohly selhat a má za následek nižší frekvenci použitelných záplat.
Perforované patchEdit
Tato varianta patch clamp metoda je velmi podobný celku-cell konfiguraci. Hlavní rozdíl spočívá v tom, že když experimentátor tvoří gigaohm těsnění, sací není používán k prasknutí patch membrány. Místo toho, elektrody, roztok obsahuje malé množství antimykotikum nebo antibiotické činidlo, jako amphothericin-B, nystatin, nebo gramicidin, který difunduje do membrány náplasti a tvoří malé póry v membráně, poskytující elektrickou přístup do nitra buňky. Při porovnání celých buněk a perforovaná náplast metody, jeden může myslet na celý-cell patch jako otevřené dveře, v nichž je kompletní výměna mezi molekulami v pipety řešení a cytoplazmě. Perforovaná náplast může být přirovnána k sítovým dveřím, které umožňují pouze výměnu určitých molekul z roztoku pipety do cytoplazmy buňky.
Výhody perforovaná náplast metoda, vzhledem k celku-mobilní nahrávky, zahrnují vlastnosti antibiotikum póry, které umožňují ustavení rovnováhy pouze malé monovalentní ionty mezi patch pipety a cytosolu, ale ne větší molekuly, které nemohou pronikat přes póry. Tato vlastnost udržuje endogenní hladiny dvojmocných iontů, jako je Ca2+ a signálních molekul, jako je cAMP. V důsledku toho lze mít záznamy celé buňky, jako v upínání celých buněk, při zachování většiny intracelulárních signalizačních mechanismů, jako v záznamech připojených k buňkám. Výsledkem je snížený průběh proudu a stabilní perforované záplaty mohou trvat déle než jednu hodinu. Nevýhody zahrnují vyšší přístupový odpor, vzhledem k celobuněčnému, v důsledku částečné membrány zabírající špičku elektrody. To může snížit aktuální rozlišení a zvýšit šum záznamu. Může také trvat značné množství času, než antibiotikum perforuje membránu (asi 15 minut pro amfotericin-B a ještě déle pro gramicidin a nystatin). Membrána pod špičkou elektrody je oslabena perforacemi tvořenými antibiotikem a může prasknout. Pokud se náplast roztrhne, záznam je pak v celobuněčném režimu, přičemž antibiotikum kontaminuje vnitřek buňky.
Uvolněné patchEdit
Volné patch clamp se liší od jiných technik, zde diskutovány v tom, že zaměstnává uvolněné těsnění (nízký elektrický odpor), spíše než pevně gigaseal používané v konvenční technika. Tato technika byla používaná již v roce 1961, jak je popsáno v dokumentu o Strickholm na impedanci svalové buňky povrchu, ale obdržel malou pozornost, dokud byl vychován znovu a dostal jméno podle Almers, Stanfield, a Stühmer v roce 1982, po patch clamp byly stanoveny jako hlavní nástroj elektrofyziologie.
K dosažení volné patch clamp na buněčné membrány, pipety pomalu směrem k buňce, dokud se elektrický odpor kontaktu mezi buňkou a pipety se zvyšuje na několik krát větší odpor, než elektroda sám. Čím blíže se pipeta dostane k membráně, tím větší je odpor špičky pipety, ale pokud se vytvoří příliš blízko těsnění a může být obtížné pipetu odstranit bez poškození buňky. Pro volné patch technika, pipety nedostane dost blízko, aby membrána tvoří gigaseal nebo trvalé připojení, ani proniknout buněčnou membránou. Buněčná membrána zůstává neporušená a nedostatek těsného těsnění vytváří malou mezeru, kterou mohou ionty procházet mimo buňku bez vstupu do pipety.
významnou výhodou volného těsnění je to, že použitá pipeta může být po záznamu opakovaně odstraněna z membrány a membrána zůstane neporušená. To umožňuje opakovaná měření na různých místech na stejné buňce, aniž by došlo k narušení integrity membrány. Tato flexibilita má být zvláště užitečné pro výzkumné pracovníky pro studium svalových buněk, jako jsou smlouvy, podle skutečné fyziologické podmínky, získání nahrávky rychle, a tak, aniž by se uchylovat k drastickým opatřením zastavit svalových vláken před kontrakcí. Hlavní nevýhodou je, že odpor mezi pipetou a membránou je značně snížen, což umožňuje proud prosakovat těsněním a významně snižuje rozlišení malých proudů. Tento únik však lze částečně napravit, což nabízí příležitost porovnat a porovnat záznamy pořízené z různých oblastí v buňce zájmu. Vzhledem k tomu se odhaduje, že technika volné náplasti může vyřešit proudy menší než 1 mA / cm2.