verschillende variaties van de basistechniek kunnen worden toegepast, afhankelijk van wat de onderzoeker wil bestuderen. De inside-out en outside-out technieken worden “uitgesneden flard” technieken genoemd, omdat het flard wordt uitgesneden (verwijderd) uit het belangrijkste lichaam van de cel. Cel-in bijlage en beide uitgesneden flardtechnieken worden gebruikt om het gedrag van individuele ionenkanalen in de sectie van membraan in bijlage aan de elektrode te bestuderen.
gehele celflarden en geperforeerde flarden stellen de onderzoeker in staat om het elektrische gedrag van de gehele cel te bestuderen, in plaats van éénkanaalstromen. Het geheel-celflard, dat lage weerstand elektrische toegang tot de binnenkant van een cel toelaat, heeft nu grotendeels vervangen hoge weerstand micro-elektrode opnametechnieken om stromen over het volledige celmembraan op te nemen.
Cell-attached patchEdit
voor deze methode, wordt de pipet verzegeld op het celmembraan om een gigaseal te verkrijgen, terwijl ervoor te zorgen dat het celmembraan intact blijft. Dit staat de registratie van stromen door enige, of een paar, ionenkanalen toe die in het Flard van membraan door de pipet worden gevangen. Door zich slechts aan de buitenkant van het celmembraan te hechten, is er zeer weinig verstoring van de celstructuur. Ook door het interieur van de cel niet te verstoren, zullen alle intracellulaire mechanismen die normaal het kanaal beïnvloeden nog steeds kunnen functioneren zoals zij fysiologisch zouden doen. Met behulp van deze methode is het ook relatief eenvoudig om de juiste configuratie te verkrijgen, en eenmaal verkregen is het vrij stabiel.
voor ligand-omheinde ionenkanalen of-kanalen die door metabotrope receptoren worden gemoduleerd, wordt de neurotransmitter of het geneesmiddel dat wordt onderzocht, gewoonlijk opgenomen in de pipetoplossing, waar het kan interageren met wat vroeger het buitenoppervlak van het membraan was. De resulterende kanaalactiviteit kan worden toegeschreven aan het geneesmiddel dat wordt gebruikt, hoewel het meestal niet mogelijk is om vervolgens de geneesmiddelconcentratie in de pipet te veranderen. De techniek is dus beperkt tot één punt in een dosisresponscurve per pleister. Daarom wordt de dosisrespons bereikt met behulp van verschillende cellen en pleisters. Nochtans, kunnen voltage-gated ionenkanalen achtereenvolgens bij verschillende membraanpotentialen in één enkele flard worden geklemd. Dit resulteert in kanaalactivering als functie van voltage, en een volledige i-V (Stroom-voltage) kromme kan in slechts één flard worden gevestigd. Een ander potentieel nadeel van deze techniek is dat, enkel zoals de intracellular wegen van de cel niet worden verstoord, zij kunnen ook niet direct worden gewijzigd.
Inside-out patchEdit
in de binnen-uit methode, is een flard van het membraan in bijlage aan de flardpipet, losgemaakt van de rest van de cel, en de cytosolic oppervlakte van het membraan wordt blootgesteld aan de externe media, of bad. Een voordeel van deze methode is dat de experimentator toegang tot de intracellulaire oppervlakte van het membraan via het bad heeft en de chemische samenstelling van wat de oppervlakte van het membraan wordt blootgesteld aan kan veranderen. Dit is nuttig wanneer een experimentator het milieu bij de intracellular oppervlakte van enige ionenkanalen wenst te manipuleren. Bijvoorbeeld, kunnen de kanalen die door intracellular ligands worden geactiveerd dan door een waaier van ligandconcentraties worden bestudeerd.
om de binnenstebuiten configuratie te bereiken, wordt de pipet aan het celmembraan bevestigd, zoals in de cel-bijgevoegde modus, en vormt een gigaseaal, en wordt vervolgens ingetrokken om een pleister van het membraan van de rest van de cel af te breken. Het trekken van een membraanflard resulteert vaak aanvankelijk in de vorming van een blaasje van membraan in het pipetuiteinde, omdat de einden van het flardmembraan samen snel na uitsnede smelten. De buitenkant van het blaasje moet dan opengebroken worden om binnenstebuiten te treden.; dit kan worden gedaan door het membraan kort door de badoplossing/lucht-interface te nemen, door blootstelling aan een lage Ca2+ – oplossing, of door Tijdelijk contact te maken met een druppel paraffine of een stuk uitgehard siliconenpolymeer.
opname door hele cellen of patchEdit door hele cellen
de gehele-celopnames impliceren het opnemen van stromen door veelvoudige kanalen gelijktijdig, over een groot gebied van het celmembraan. De elektrode wordt op zijn plaats gelaten op de cel, zoals in cel-in bijlage opgenomen opnames, maar meer zuiging wordt toegepast om het membraanflard te breken, waarbij toegang van het binnenland van de pipet aan de intracellular ruimte van de cel wordt verstrekt. Dit biedt een middel om te beheren en te bestuderen hoe behandelingen (b. v. drugs) cellen in real time kunnen beïnvloeden. Zodra de pipet aan het celmembraan is bevestigd, zijn er twee methoden om de pleister te breken. De eerste is door meer afzuiging aan te brengen. De hoeveelheid en de duur van deze zuiging hangt af van het type cel en de grootte van de pipet. De andere methode vereist dat een grote stroompuls door de pipet wordt gestuurd. Hoeveel stroom wordt toegepast en de duur van de puls hangt ook af van het type cel. Voor sommige soorten cellen is het handig om beide methoden tegelijkertijd toe te passen om de patch te breken.
het voordeel van het opnemen van een flardklem met hele cellen ten opzichte van het opnemen van een scherpe elektrodetechniek is dat de grotere opening aan de punt van de flardklem elektrode een lagere weerstand biedt en dus een betere elektrische toegang tot de binnenkant van de cel. Een nadeel van deze techniek is dat omdat het volume van de elektrode groter is dan het volume van de cel, de oplosbare inhoud van het interieur van de cel langzaam zal worden vervangen door de inhoud van de elektrode. Dit wordt aangeduid als de elektrode “dialyseren” de cel inhoud. Na een tijdje, om het even welke eigenschappen van de cel die van oplosbare intracellular inhoud afhangen worden veranderd. De gebruikte pipetoplossing benadert gewoonlijk het hoog-kaliummilieu van het binnenland van de cel om om het even welke veranderingen te minimaliseren die dit kan veroorzaken. Er is vaak een periode aan het begin van een hele-cel opname wanneer men metingen kan doen voordat de cel is gedialyseerd.
outside-out patchEdit
de naam “Buiten-Buiten” benadrukt zowel de complementariteit van deze techniek aan de binnen-buiten techniek, en het feit dat het de externe eerder dan intracellular oppervlakte van het celmembraan op de buitenkant van het Flard van membraan, met betrekking tot de flardelektrode plaatst.
de vorming van een Outside-out patch begint met een opname-configuratie voor hele cellen. Nadat de geheel-celconfiguratie wordt gevormd, wordt de elektrode langzaam teruggetrokken uit de cel, die een bol van membraan toestaat om uit de cel te bleb. Wanneer de elektrode ver genoeg wordt getrokken, zal deze bleb zich losmaken van de cel en zich hervormen als een convex membraan aan het uiteinde van de elektrode (zoals een bal die Open is bij de elektrodepunt), met de originele buitenkant van het membraan naar buiten gericht van de elektrode. Zoals de afbeelding rechts laat zien, betekent dit dat de vloeistof in de pipet de intracellulaire vloeistof simuleert, terwijl een onderzoeker vrij is om de pipet en de bleb met zijn kanalen naar een ander bad van oplossing te verplaatsen. Terwijl meerdere kanalen in een bleb van membraan kunnen bestaan, zijn de enige kanaalopnamen ook mogelijk in deze bouw als de bleb van losgemaakt membraan klein is en slechts één kanaal bevat.Het patchen met buitenzijde geeft de experimentator de mogelijkheid de eigenschappen van een ionenkanaal te onderzoeken wanneer het van de cel wordt geïsoleerd en achtereenvolgens aan verschillende oplossingen op het extracellulaire oppervlak van het membraan wordt blootgesteld. De experimentator kan het zelfde flard met een verscheidenheid van oplossingen in een vrij korte hoeveelheid tijd perfuse, en als het kanaal door een neurotransmitter of drug van het extracellulaire gezicht wordt geactiveerd, kan een dosis-responscurve dan worden verkregen. Deze capaciteit om stroom door precies het zelfde stuk van membraan in verschillende oplossingen te meten is het duidelijke voordeel van het buiten-uit flard met betrekking tot de cel-in bijlage gemaakte methode. Aan de andere kant, het is moeilijker te bereiken. Het langere vormingsproces omvat meer stappen die kunnen mislukken en resulteert in een lagere frequentie van bruikbare patches.
geperforeerde patchEdit
deze variatie van de methode van de flardklem is zeer gelijkaardig aan de gehele-celconfiguratie. Het belangrijkste verschil ligt in het feit dat wanneer de experimentator de gigaohm-afdichting vormt, zuiging niet wordt gebruikt om het flardmembraan te breken. In plaats daarvan bevat de elektrodeoplossing kleine hoeveelheden schimmeldodende of antibiotische agent, zoals amphothericin-B, nystatine, of gramicidin, die in het membraanflard verspreidt en kleine poriën in het membraan vormt, die elektrotoegang tot het celbinnenland verstrekken. Wanneer men de geheel-cel en geperforeerde flardmethodes vergelijkt, kan men van het geheel-celflard denken als een open deur, waarin er volledige uitwisseling tussen molecules in de pipetoplossing en het cytoplasma is. Het geperforeerde flard kan met een schermdeur worden vergeleken die slechts de uitwisseling van bepaalde molecules van de pipetoplossing aan het cytoplasma van de cel toestaat.
voordelen van de geperforeerde pleistermethode ten opzichte van opnamen in hele cellen zijn onder meer de eigenschappen van de antibiotische poriën, die het mogelijk maken om alleen kleine monovalente ionen tussen de pleisterpipet en het cytosol in evenwicht te brengen, maar niet van grotere moleculen die niet door de poriën kunnen doordringen. Deze eigenschap handhaaft endogene niveaus van divalente ionen zoals Ca2+ en signalerende molecules zoals cAMP. Bijgevolg, kan men opnames van de volledige cel, zoals in geheel-cel flard het vastklemmen hebben, terwijl het behouden van de meeste intracellular signalerende mechanismen, zoals in cel-in bijlage opgenomen opnames. Als gevolg hiervan is er een verminderde stroomafname en kunnen stabiele geperforeerde patchopnames langer dan een uur duren. Nadelen omvatten een hogere toegangsweerstand, ten opzichte van geheel-cel, toe te schrijven aan het gedeeltelijke membraan die het uiteinde van de elektrode bezetten. Dit kan de huidige resolutie verminderen en de opname ruis verhogen. Het kan ook een aanzienlijke tijd duren voordat het antibioticum het membraan perforeert (ongeveer 15 minuten voor amfothericine-B, en zelfs langer voor gramicidin en nystatine). Het membraan onder de elektrodeuiteinde wordt verzwakt door de perforaties die door het antibioticum worden gevormd en kan scheuren. Als het Flard breekt, is de opname dan in geheel-celwijze, met antibioticum besmettend de binnenkant van de cel.
Losse patchEdit
de losse flardklem is verschillend van de andere hier besproken technieken in dat het een losse verbinding (lage elektrische weerstand) eerder dan de strakke gigaseal gebruikt in de conventionele techniek gebruikt. Deze techniek werd al in het jaar 1961 gebruikt, zoals beschreven in een artikel van Strickholm over de impedantie van het oppervlak van een spiercel, maar kreeg weinig aandacht totdat hij opnieuw werd opgevoed en een naam kreeg door Almers, Stanfield en Stühmer in 1982, nadat patch clamp was vastgesteld als een belangrijk instrument van elektrofysiologie.
om een losse flardklem op een celmembraan te verkrijgen, wordt de pipet langzaam naar de cel verplaatst, totdat de elektrische weerstand van het contact tussen de cel en de pipet toeneemt tot een paar keer grotere weerstand dan die van de elektrode alleen. Hoe dichter de pipet bij het membraan komt, hoe groter de weerstand van de pipetpunt wordt, maar als te dicht een afdichting wordt gevormd, en het kan moeilijk worden om de pipet te verwijderen zonder de cel te beschadigen. Voor de losse flard techniek, komt de pipet niet dicht genoeg bij het membraan om een gigaseal of een permanente verbinding te vormen, noch om het celmembraan te doorboren. Het celmembraan blijft intact, en het ontbreken van een strakke verbinding leidt tot een klein gat waardoor ionen buiten de cel kunnen passeren zonder de pipet binnen te gaan.
een belangrijk voordeel van de losse verzegeling is dat de gebruikte pipet na opname herhaaldelijk uit het membraan kan worden verwijderd en dat het membraan intact blijft. Dit staat herhaalde metingen in een verscheidenheid van plaatsen op dezelfde cel toe zonder de integriteit van het membraan te vernietigen. Deze flexibiliteit is vooral nuttig voor onderzoekers voor het bestuderen van spiercellen als ze contract onder echte fysiologische omstandigheden, het verkrijgen van opnames snel, en dit te doen zonder toevlucht te nemen tot drastische maatregelen om te stoppen met de spiervezels uit contracting. Een groot nadeel is dat de weerstand tussen de pipet en het membraan sterk wordt verminderd, waardoor stroom door de afdichting kan lekken en de resolutie van kleine stromen aanzienlijk wordt verminderd. Deze lekkage kan gedeeltelijk worden gecorrigeerd voor, echter, die de mogelijkheid biedt om te vergelijken en contrast opnames gemaakt van verschillende gebieden op de cel van belang. Gegeven dit, is men geschat dat de losse flardtechniek stromen kleiner dan 1 mA/cm2 kan oplossen.