연구자가 연구하고자하는 것에 따라 기본 기술의 여러 변형을 적용 할 수 있습니다. 패치가 셀의 본체에서 절제(제거)되기 때문에 내부 및 외부 기술을”절제 패치”기술이라고합니다. 셀 연결 및 두 절제 패치 기법 전극에 연결 된 막의 섹션에서 개별 이온 채널의 동작을 연구 하는 데 사용 됩니다.
전체 셀 패치 및 천공 패치를 통해 연구원은 단일 채널 전류 대신 전체 셀의 전기적 거동을 연구 할 수 있습니다. 셀의 내부에 낮은 저항 전기 액세스를 가능 하 게 하는 전체 셀 패치 지금 크게 전체 세포 막에 걸쳐 전류를 기록 하는 높은 저항 마이크로 전극 기록 기술을 대체 했다.
셀 부착 패치편집
이 방법을 위해,피펫은 세포막에 밀봉되어 세포막이 그대로 유지되도록하면서 기가 실을 얻습니다. 이를 통해 피펫이 캡처 한 멤브레인 패치에 포함 된 단일 또는 몇 개의 이온 채널을 통해 전류를 기록 할 수 있습니다. 세포막의 외면에만 부착하면 세포 구조의 교란이 거의 없습니다. 또한,세포의 내부를 방해하지 않음으로써,일반적으로 채널에 영향을 미치는 모든 세포 내 메커니즘은 여전히 생리적으로 기능 할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 적절한 구성을 얻는 것도 비교적 쉽고 일단 얻으면 상당히 안정적입니다.
대사성 수용체에 의해 조절되는 리간드 게이트 이온 채널 또는 채널의 경우,연구중인 신경 전달 물질 또는 약물은 일반적으로 피펫 용액에 포함되며,여기서 막의 외부 표면이었던 것과 상호 작용할 수 있습니다. 그 결과 채널 활동은 사용되는 약물에 기인 할 수 있지만 일반적으로 피펫 내부의 약물 농도를 변경할 수는 없습니다. 따라서 이 기술은 패치 당 선량 반응 곡선의 한 지점으로 제한됩니다. 따라서 용량 반응은 여러 세포와 패치를 사용하여 수행됩니다. 그러나 전압 게이트 이온 채널은 단일 패치에서 서로 다른 멤브레인 전위에서 연속적으로 클램핑 될 수 있습니다. 이것은 전압의 함수로 수로 활성화 귀착되고,완전한 입력 전압(현재 전압)곡선은 단지 1 개의 헝겊 조각에서 설치될 수 있습니다. 이 기술의 또 다른 잠재적 인 단점은 세포의 세포 내 경로가 방해받지 않는 것처럼 직접 수정할 수 없다는 것입니다.
인사이드 아웃 패치편집
내부-아웃 방법에서,멤브레인의 패치는 패치 피펫에 부착되고,세포의 나머지 부분으로부터 분리되고,멤브레인의 세포질 표면은 외부 매체 또는 욕조에 노출된다. 이 방법의 한 가지 장점은 실험자가 욕조를 통해 막의 세포 내 표면에 접근 할 수 있고 막의 표면이 노출되는 것의 화학적 조성을 변경할 수 있다는 것입니다. 이것은 실험자가 단 하나 이온 수로의 세포내 표면에 환경을 교묘히 다룰 것을 바랄 때 유용합니다. 예를 들어,세포 내 리간드에 의해 활성화되는 채널은 다양한 리간드 농도를 통해 연구 될 수 있습니다.
인사이드 아웃 구성을 달성하기 위해,피펫은 세포 부착 모드에서와 같이 세포막에 부착되어 기가 실을 형성 한 다음 수축되어 나머지 셀에서 멤브레인 패치를 끊습니다. 멤브레인 패치를 당기는 것은 종종 패치 멤브레인의 끝이 절단 후 빠르게 융합되기 때문에 처음에는 피펫 팁에서 멤브레인 소포가 형성됩니다. 소포의 외부 얼굴은 그 때 안쪽으로 밖으로 형태로 들어가기 위하여 열리는 끊겨야 합니다; 이것은 욕 용액/공기 계면을 통해 간단히 멤브레인을 취하거나,낮은 칼슘 2+용액에 노출하거나,순간적으로 파라핀 방울 또는 경화 된 실리콘 중합체 조각과 접촉함으로써 수행 될 수있다.
전체 셀 기록 또는 전체 셀 패치편집
전체 세포 녹음은 세포막의 넓은 영역에 걸쳐 동시에 여러 채널을 통해 전류를 기록하는 것을 포함합니다. 전극은 세포 부착 기록에서와 같이,셀에 장소에 남아 있지만,더 흡입 따라서 셀의 세포 내 공간에 피펫의 내부에서 액세스를 제공,막 패치를 파열에 적용됩니다. 이것은 치료(예:약물)가 실시간으로 세포에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 관리하고 연구 할 수있는 수단을 제공합니다. 피펫이 세포막에 부착되면 패치를 깨는 두 가지 방법이 있습니다. 첫 번째는 더 많은 흡입을 적용하는 것입니다. 이 흡입의 양과 지속 시간은 셀의 유형과 피펫의 크기에 따라 다릅니다. 다른 방법은 피펫을 통해 전송 될 큰 전류 펄스를 필요로한다. 얼마나 많은 전류가 적용되고 펄스의 지속 시간은 셀의 유형에 따라 다릅니다. 일부 유형의 셀의 경우 패치를 끊기 위해 두 가지 방법을 동시에 적용하는 것이 편리합니다.
날카로운 전극 기술 기록에 비해 전체 셀 패치 클램프 기록의 장점은 패치 클램프 전극의 선단에 더 큰 개구부가 낮은 저항을 제공하고,따라서 셀의 내부에 더 나은 전기적 접근을 제공한다는 것이다. 이 기술의 단점은 전극의 부피가 셀의 부피보다 크기 때문에 셀 내부의 용해성 내용물이 천천히 전극의 내용물로 대체된다는 것이다. 이것은 전극이 세포의 내용을”투석”하는 것으로 지칭된다. 잠시 후,용해성 세포 내 내용에 의존하는 세포의 모든 특성이 변경 될 것입니다. 일반적으로 사용되는 피펫 용액은 세포 내부의 고 칼륨 환경에 근접하여 이로 인해 발생할 수있는 변화를 최소화합니다. 세포가 투석되기 전에 하나 측정을 취할 수있는 전체 셀 기록의 시작 부분에 기간이 종종있다.
아웃사이드 패치편집
“외부 아웃”이라는 이름은 이 기술이 내부 아웃 기술에 대한 상보성과 패치 전극과 관련하여 세포막의 세포 내 표면이 아닌 외부를 멤브레인의 패치 외부에 배치한다는 사실을 강조합니다.
외부 아웃 패치의 형성은 전체 셀 기록 구성으로 시작됩니다. 전체 셀 구성이 형성된 후,전극은 세포로부터 천천히 회수되어 멤브레인의 전구가 세포로부터 빠져 나올 수 있습니다. 전극이 충분히 멀리 당겨지면,이 블레 브는 세포에서 분리되어 전극의 끝 부분에있는 볼록 막(전극 팁에서 열린 공처럼)으로 재구성되며,멤브레인의 원래 외부는 전극에서 바깥쪽으로 향하게됩니다. 오른쪽 이미지에서 볼 수 있듯이,이것은 피펫 내부의 유체가 세포 내 유체를 시뮬레이션하는 반면,연구원은 피펫과 채널을 가진 블렛을 다른 용액 욕조로 자유롭게 옮길 수 있음을 의미합니다. 여러 채널이 멤브레인의 블레 브에 존재할 수 있지만,분리 된 멤브레인의 블레 브가 작고 하나의 채널 만 포함되어있는 경우 단일 채널 녹음이 이러한 형태에서도 가능합니다.
외부-아웃 패치는 실험자에게 이온 채널이 세포로부터 분리되고 막의 세포 외 표면의 다른 용액에 연속적으로 노출 될 때 이온 채널의 특성을 검사 할 수있는 기회를 제공합니다. 실험자는 시간 상대적으로 짧은 금액에 있는 다양한 해결책을 가진 동일한 헝겊 조각을 관류할 수 있고,수로가 세포외 얼굴에서 신경전달물질 또는 약에 의해 활성화되는 경우에,복용량 응답 곡선은 그 때 얻어질 수 있습니다. 다른 해결책에 있는 막의 정확하게 동일한 조각을 통해서 현재를 측정하는 이 기능은 세포 붙어 있던 방법에 관련된 외부 밖으로 헝겊 조각의 명백한 이점입니다. 다른 한편으로,그것은 달성 하기 어려운. 더 긴 형성 과정은 실패 할 수있는 더 많은 단계를 포함하고 사용 가능한 패치의 빈도가 낮아집니다.
천공 패치편집
패치 클램프 방식의 이러한 변형은 전체 셀 구성과 매우 유사합니다. 주요 차이점은 실험자가 기가 옴 씰을 형성 할 때 흡입이 패치 멤브레인을 파열시키는 데 사용되지 않는다는 사실에 있습니다. 대신,전극 용액은 막 패치로 확산 및 세포 내부에 전기적 액세스를 제공,막에 작은 기공을 형성하는 암포 테리 신-비,나이 스타틴,또는 그라 미시 딘과 같은 항진균제 또는 항생제의 소량을 포함한다. 전체 셀 및 천공 패치 방법을 비교할 때 전체 셀 패치를 피펫 용액의 분자와 세포질 사이의 완전한 교환이있는 열린 문으로 생각할 수 있습니다. 천공 된 패치는 피펫 용액에서 세포의 세포질로 특정 분자를 교환 할 수있는 스크린 도어에 비유 할 수 있습니다.
천공 패치 방법의 장점은 전체 세포 기록에 비해 패치 피펫과 세포질 사이의 작은 1 가 이온의 평형을 허용하는 항생제 기공의 특성을 포함하지만 기공을 통해 침투 할 수없는 더 큰 분자는 아닙니다. 이 속성은 다음과 같은 2 가 이온의 내인성 수준을 유지합니다. 따라서,하나 전체 셀 패치 클램핑,셀 연결 녹음에서와 같이 대부분의 세포내 신호 메커니즘을 유지 하면서 전체 셀의 녹음을 가질 수 있습니다. 그 결과,전류 감소가 감소되고,안정적인 천공 패치 녹음은 1 시간 이상 지속될 수 있습니다. 단점은 전극의 팁을 차지하는 부분 막으로 인해 전체 셀에 비해 높은 액세스 저항을 포함합니다. 이렇게하면 현재 해상도가 감소하고 기록 노이즈가 증가 할 수 있습니다. 또한 항생제가 막을 천공하는 데 상당한 시간이 걸릴 수 있습니다(암포 테리 신-비의 경우 약 15 분,그라 미시 딘 및 니 스타틴의 경우 더 오래). 전극 팁 아래의 막은 항생제에 의해 형성된 천공에 의해 약화되고 파열 될 수 있습니다. 헝겊 조각이 파열하는 경우에,기록은 항생제가 전체 세포 형태에,세포의 안을 오염 상태에서 그 때 입니다.
느슨한 패치편집
느슨한 패치 클램프는 기존의 기술에 사용되는 단단한 기가 실이 아닌 느슨한 씰(낮은 전기 저항)을 사용한다는 점에서 여기에서 논의 된 다른 기술과 다릅니다. 이 기술은 근육 세포 표면의 임피던스에 관한 스트릭홈의 논문에서 설명한 바와 같이 1961 년 초에 사용되었지만,패치 클램프가 전기 생리학의 주요 도구로 확립 된 후 1982 년에 다시 제기되고 알 머스,스탠 필드 및 세인트 허머에 의해 이름이 지정 될 때까지 거의 주목을받지 못했습니다.
세포막에 느슨한 패치 클램프를 달성하기 위해 피펫은 셀과 피펫 사이의 접촉의 전기 저항이 전극보다 몇 배 더 큰 저항으로 증가 할 때까지 셀로 천천히 이동합니다. 피펫이 멤브레인에 가까워 질수록 피펫 팁의 저항이 커지지만 씰이 너무 가까워지면 셀을 손상시키지 않고 피펫을 제거하기가 어려워 질 수 있습니다. 느슨한 패치 기술의 경우,피펫은 기가 실 또는 영구적 인 연결을 형성하거나 세포막을 관통 할 정도로 막에 가까이 가지 않습니다. 세포막은 그대로 유지,꽉 씰의 부족은 이온이 피펫을 입력하지 않고 세포 외부를 통과 할 수있는 작은 간격을 생성.
느슨한 씰의 중요한 장점은 기록 후 사용되는 피펫을 멤브레인에서 반복적으로 제거 할 수 있으며 멤브레인은 그대로 유지된다는 것입니다. 이것은 막의 완전성을 파괴하기 없이 동일한 세포에 다양한 위치에 있는 반복한 측정을 허용합니다. 이러한 유연성은 실제 생리 학적 조건 하에서 계약으로 근육 세포를 연구 빠르게 기록을 획득하고,계약에서 근육 섬유를 중지 과감한 조치에 의존하지 않고 그렇게하기위한 연구자들에게 특히 유용하고있다. 주요 단점은 피펫과 멤브레인 사이의 저항이 크게 감소되어 씰을 통해 전류가 누출되고 작은 전류의 분해능이 크게 감소한다는 것입니다. 이 누출은 부분적으로 비교 및 관심의 셀에 다른 영역에서 만든 기록을 대조 할 수있는 기회를 제공하는,그러나,보정 할 수있다. 이 점을 감안할 때 느슨한 패치 기술은 1 밀리그램/센티미터 2 보다 작은 전류를 해결할 수 있다고 추정되었습니다.