Possono essere applicate diverse varianti della tecnica di base, a seconda di ciò che il ricercatore vuole studiare. Le tecniche inside-out e outside-out sono chiamate tecniche di “patch asportato”, perché il cerotto viene asportato (rimosso) dal corpo principale della cellula. Cell-attached ed entrambe le tecniche di patch asportate sono utilizzate per studiare il comportamento dei singoli canali ionici nella sezione di membrana attaccata all’elettrodo.
La patch a cella intera e la patch perforata consentono al ricercatore di studiare il comportamento elettrico dell’intera cella, anziché le correnti a canale singolo. La patch di tutta la cellula, che consente l’accesso elettrico a bassa resistenza all’interno di una cellula, ha ora ampiamente sostituito le tecniche di registrazione dei microelettrodi ad alta resistenza per registrare le correnti attraverso l’intera membrana cellulare.
Patch allegatamodifica
Per questo metodo, la pipetta viene sigillata sulla membrana cellulare per ottenere un gigaseal, garantendo nel contempo che la membrana cellulare rimanga intatta. Ciò consente la registrazione delle correnti attraverso singoli, o pochi, canali ionici contenuti nella patch di membrana catturata dalla pipetta. Attaccandosi solo all’esterno della membrana cellulare, c’è molto poco disturbo della struttura cellulare. Inoltre, non interrompendo l’interno della cellula, tutti i meccanismi intracellulari che normalmente influenzano il canale saranno ancora in grado di funzionare come farebbero fisiologicamente. Utilizzando questo metodo è anche relativamente facile ottenere la giusta configurazione, e una volta ottenuto è abbastanza stabile.
Per i canali ionici ligandi o canali modulati dai recettori metabotropici, il neurotrasmettitore o il farmaco in fase di studio è solitamente incluso nella soluzione della pipetta, dove può interagire con quella che era la superficie esterna della membrana. L’attività del canale risultante può essere attribuita al farmaco utilizzato, anche se di solito non è possibile modificare la concentrazione del farmaco all’interno della pipetta. La tecnica è quindi limitata a un punto della curva dose-risposta per cerotto. Pertanto, la risposta alla dose viene ottenuta utilizzando diverse cellule e cerotti. Tuttavia, i canali ionici voltaggio-gated possono essere bloccati successivamente ai potenziali differenti della membrana in una singola toppa. Ciò si traduce in attivazione del canale in funzione della tensione e una curva I-V (corrente-tensione) completa può essere stabilita in una sola patch. Un altro potenziale inconveniente di questa tecnica è che, proprio come le vie intracellulari della cellula non sono disturbate, non possono essere modificate direttamente.
PATCH interna-outmodifica
Nel metodo inside-out, una patch della membrana è attaccata alla pipetta patch, staccata dal resto della cellula, e la superficie citosolica della membrana è esposta al supporto esterno o al bagno. Un vantaggio di questo metodo è che lo sperimentatore ha accesso alla superficie intracellulare della membrana tramite il bagno e può modificare la composizione chimica di ciò a cui è esposta la superficie della membrana. Questo è utile quando uno sperimentatore desidera manipolare l’ambiente sulla superficie intracellulare di singoli canali ionici. Ad esempio, i canali attivati dai ligandi intracellulari possono quindi essere studiati attraverso una gamma di concentrazioni di ligandi.
Per ottenere la configurazione inside-out, la pipetta viene attaccata alla membrana cellulare come nella modalità cell-attached, formando un gigaseal, e viene quindi retratta per rompere una porzione di membrana dal resto della cellula. Tirando fuori una patch di membrana spesso si traduce inizialmente nella formazione di una vescicola di membrana nella punta della pipetta, perché le estremità della membrana patch fusibile insieme rapidamente dopo l’asportazione. La faccia esterna della vescicola deve quindi essere aperta per entrare in modalità inside-out; ciò può essere fatto prendendo brevemente la membrana attraverso l’interfaccia soluzione/aria del bagno, mediante esposizione a una soluzione a basso Ca2+, o facendo momentaneamente contatto con una goccia di paraffina o un pezzo di polimero siliconico polimerico.
Registrazione a cella intera o PATCH a cella interamodifica
Le registrazioni di intere cellule comportano la registrazione di correnti attraverso più canali contemporaneamente, su un’ampia regione della membrana cellulare. L’elettrodo viene lasciato in posizione sulla cellula, come nelle registrazioni attaccate alle cellule, ma viene applicata più aspirazione per rompere il cerotto della membrana, fornendo così l’accesso dall’interno della pipetta allo spazio intracellulare della cellula. Ciò fornisce un mezzo per amministrare e studiare come i trattamenti (ad esempio i farmaci) possono influenzare le cellule in tempo reale. Una volta che la pipetta è attaccata alla membrana cellulare, ci sono due metodi per rompere il cerotto. Il primo è applicando più aspirazione. La quantità e la durata di questa aspirazione dipendono dal tipo di cella e dalle dimensioni della pipetta. L’altro metodo richiede un grande impulso di corrente da inviare attraverso la pipetta. La quantità di corrente applicata e la durata dell’impulso dipendono anche dal tipo di cella. Per alcuni tipi di celle, è conveniente applicare entrambi i metodi contemporaneamente per rompere la patch.
Il vantaggio della registrazione del morsetto patch a celle intere rispetto alla registrazione della tecnica dell’elettrodo sharp è che l’apertura più grande sulla punta dell’elettrodo patch clamp fornisce una resistenza inferiore e quindi un migliore accesso elettrico all’interno della cella. Uno svantaggio di questa tecnica è che poiché il volume dell’elettrodo è maggiore del volume della cella, il contenuto solubile dell’interno della cella verrà lentamente sostituito dal contenuto dell’elettrodo. Questo è indicato come l’elettrodo “dialyzing” il contenuto della cella. Dopo un po’, tutte le proprietà della cellula che dipendono dal contenuto intracellulare solubile saranno alterate. La soluzione di pipetta utilizzata di solito si avvicina all’ambiente ad alto contenuto di potassio dell’interno della cellula per ridurre al minimo le modifiche che ciò può causare. C’è spesso un periodo all’inizio di una registrazione di tutta la cellula in cui si possono prendere misure prima che la cellula sia stata dializzata.
PATCH esterna-outmodifica
Il nome di “fuori-fuori”, sottolinea questa tecnica la complementarità all’interno tecnica, e il fatto che esso pone l’esterno piuttosto che intracellulare superficie della membrana cellulare all’esterno della patch di membrana, in relazione alla patch elettrodo.
La formazione di una patch esterna inizia con una configurazione di registrazione a celle intere. Dopo aver formato la configurazione dell’intera cella, l’elettrodo viene lentamente ritirato dalla cella, consentendo a un bulbo di membrana di fuoriuscire dalla cella. Quando l’elettrodo viene tirato abbastanza lontano, questo bleb si staccherà dalla cella e si riformerà come una membrana convessa all’estremità dell’elettrodo (come una palla aperta sulla punta dell’elettrodo), con l’esterno originale della membrana rivolto verso l’esterno dall’elettrodo. Come mostra l’immagine a destra, ciò significa che il fluido all’interno della pipetta simulerà il fluido intracellulare, mentre un ricercatore è libero di spostare la pipetta e il bleb con i suoi canali in un altro bagno di soluzione. Mentre più canali possono esistere in un bleb di membrana, registrazioni a canale singolo sono possibili anche in questa conformazione se il bleb di membrana staccata è piccolo e contiene solo un canale.
La patch esterna-esterna dà allo sperimentatore l’opportunità di esaminare le proprietà di un canale ionico quando è isolato dalla cellula ed esposto successivamente a diverse soluzioni sulla superficie extracellulare della membrana. Lo sperimentatore può perfondere la stessa patch con una varietà di soluzioni in un tempo relativamente breve, e se il canale viene attivato da un neurotrasmettitore o un farmaco dalla faccia extracellulare, si può ottenere una curva dose-risposta. Questa capacità di misurare la corrente attraverso esattamente lo stesso pezzo di membrana in diverse soluzioni è il netto vantaggio della patch esterna rispetto al metodo cell-attached. D’altra parte, è più difficile da realizzare. Il processo di formazione più lungo comporta più passaggi che potrebbero fallire e si traduce in una minore frequenza di patch utilizzabili.
Patch perforatamodifica
Questa variazione del metodo patch clamp è molto simile alla configurazione dell’intera cella. La differenza principale sta nel fatto che quando lo sperimentatore forma il sigillo gigaohm, l’aspirazione non viene utilizzata per rompere la membrana del cerotto. Invece, la soluzione di elettrodo contiene piccole quantità di un agente antifungino o antibiotico, come amfotericina-B, nistatina o gramicidina, che si diffonde nel cerotto della membrana e forma piccoli pori nella membrana, fornendo accesso elettrico all’interno della cellula. Quando si confrontano i metodi di patch a cellule intere e perforate, si può pensare alla patch a cellule intere come a una porta aperta, in cui vi è uno scambio completo tra le molecole nella soluzione di pipetta e il citoplasma. Il cerotto perforato può essere paragonato a una porta dello schermo che consente solo lo scambio di alcune molecole dalla soluzione della pipetta al citoplasma della cellula.
I vantaggi del metodo patch perforato, rispetto alle registrazioni a cellule intere, includono le proprietà dei pori antibiotici, che consentono l’equilibrio solo di piccoli ioni monovalenti tra la pipetta patch e il citosol, ma non di molecole più grandi che non possono permeare attraverso i pori. Questa proprietà mantiene i livelli endogeni di ioni bivalenti come Ca2+ e molecole di segnalazione come cAMP. Di conseguenza, si possono avere registrazioni dell’intera cellula, come nel patch clamp di tutta la cellula, pur mantenendo la maggior parte dei meccanismi di segnalazione intracellulare, come nelle registrazioni attaccate alle cellule. Di conseguenza, si riduce il rundown di corrente e le registrazioni di patch perforate stabili possono durare più di un’ora. Gli svantaggi includono una maggiore resistenza all’accesso, rispetto all’intera cella, a causa della membrana parziale che occupa la punta dell’elettrodo. Ciò potrebbe ridurre la risoluzione corrente e aumentare il rumore di registrazione. Può anche richiedere una notevole quantità di tempo per l’antibiotico per perforare la membrana (circa 15 minuti per amfotericina-B, e anche più a lungo per gramicidina e nistatina). La membrana sotto la punta dell’elettrodo è indebolita dalle perforazioni formate dall’antibiotico e può rompersi. Se la patch si rompe, la registrazione è quindi in modalità a cellula intera, con antibiotico che contamina l’interno della cellula.
Patch allentatomodifica
Il morsetto allentato della toppa è differente dalle altre tecniche discusse qui in quanto impiega una guarnizione sciolta (resistenza elettrica bassa) piuttosto che il gigaseal stretto utilizzato nella tecnica convenzionale. Questa tecnica è stata utilizzata già nel 1961, come descritto in un articolo di Strickholm sull’impedenza della superficie di una cellula muscolare, ma ha ricevuto poca attenzione fino a quando non è stato portato di nuovo e dato un nome da Almers, Stanfield e Stühmer nel 1982, dopo che patch clamp era stato stabilito come uno strumento importante dell’elettrofisiologia.
Per ottenere un morsetto patch sciolto su una membrana cellulare, la pipetta viene spostato lentamente verso la cella, fino a quando la resistenza elettrica del contatto tra la cella e la pipetta aumenta a un paio di volte maggiore resistenza di quella del solo elettrodo. Più la pipetta si avvicina alla membrana, maggiore è la resistenza della punta della pipetta, ma se troppo vicino si forma un sigillo e potrebbe diventare difficile rimuovere la pipetta senza danneggiare la cellula. Per la tecnica del cerotto sciolto, la pipetta non si avvicina abbastanza alla membrana per formare una connessione gigaseale o permanente, né per perforare la membrana cellulare. La membrana cellulare rimane intatta e la mancanza di una tenuta stretta crea un piccolo spazio attraverso il quale gli ioni possono passare all’esterno della cellula senza entrare nella pipetta.
Un vantaggio significativo del sigillo allentato è che la pipetta utilizzata può essere rimossa ripetutamente dalla membrana dopo la registrazione e la membrana rimarrà intatta. Ciò consente misurazioni ripetute in una varietà di posizioni sulla stessa cella senza distruggere l’integrità della membrana. Questa flessibilità è stata particolarmente utile per i ricercatori per studiare le cellule muscolari che si contraggono in condizioni fisiologiche reali, ottenendo rapidamente le registrazioni e facendo così senza ricorrere a misure drastiche per impedire alle fibre muscolari di contrarsi. Uno svantaggio principale è che la resistenza tra la pipetta e la membrana è notevolmente ridotta, consentendo alla corrente di fuoriuscire attraverso la guarnizione e riducendo significativamente la risoluzione delle piccole correnti. Questa perdita può essere parzialmente corretta, tuttavia, che offre l’opportunità di confrontare e contrastare le registrazioni effettuate da diverse aree sulla cella di interesse. Dato questo, è stato stimato che la tecnica del cerotto sciolto può risolvere correnti inferiori a 1 mA/cm2.