az alaptechnika számos változata alkalmazható, attól függően, hogy a kutató mit akar tanulni. Az inside-out és out-out technikákat “kivágott tapasz” technikáknak nevezzük, mivel a tapaszt kivágják (eltávolítják) a sejt fő testéből. Cell-attached és mindkét kivágott patch technikákat alkalmaznak az egyes ioncsatornák viselkedésének tanulmányozására az elektródához csatlakoztatott membránszakaszban.
a teljes sejtes tapasz és a perforált tapasz lehetővé teszi a kutató számára, hogy az egycsatornás áramok helyett az egész sejt elektromos viselkedését tanulmányozza. A teljes cellás tapasz, amely lehetővé teszi az alacsony ellenállású elektromos hozzáférést a cella belsejéhez, mára nagyrészt felváltotta a nagy ellenállású mikroelektróda felvételi technikákat az áramok rögzítésére a teljes sejtmembránon.
Cell-attached patchszerkesztés
ehhez a módszerhez a pipettát a sejtmembránra lezárják, hogy gigasealt kapjanak, miközben biztosítják, hogy a sejtmembrán sértetlen maradjon. Ez lehetővé teszi az áramok rögzítését egyetlen vagy néhány ioncsatornán keresztül, amelyek a pipetta által rögzített membrán tapaszában vannak. Ha csak a sejtmembrán külsejéhez kapcsolódik, a sejtszerkezet nagyon kevés zavart okoz. Továbbá, ha nem zavarja meg a sejt belsejét, minden intracelluláris mechanizmus, amely általában befolyásolja a csatornát, továbbra is képes működni, mint fiziológiailag. Ezzel a módszerrel is viszonylag könnyű megszerezni a megfelelő konfigurációt, és miután megkapta, meglehetősen stabil.
a metabotrop receptorok által Modulált ligandum-kapu ioncsatornák vagy csatornák esetében a vizsgált neurotranszmitter vagy gyógyszer általában a pipettaoldatban található, ahol kölcsönhatásba léphet a membrán külső felületével. A kapott csatornaaktivitás az alkalmazott gyógyszernek tulajdonítható, bár általában nem lehetséges a pipettán belüli gyógyszerkoncentráció megváltoztatása. A technika tehát tapaszonként egy dózis-válasz görbe egy pontjára korlátozódik. Ezért a dózisreakció több sejt és tapasz segítségével valósul meg. A feszültségtől függő ioncsatornák azonban egymás után rögzíthetők különböző membránpotenciáloknál egyetlen tapaszban. Ez a csatorna aktiválását eredményezi a feszültség függvényében, és egy teljes i-V (áram-feszültség) görbe csak egy patchben hozható létre. Ennek a technikának egy másik lehetséges hátránya, hogy ugyanúgy, ahogy a sejt intracelluláris útvonalai nem zavartak, azokat sem lehet közvetlenül módosítani.
belső patchszerkesztés
az inside-out módszernél a membrán tapaszát a tapasz pipettához rögzítik, leválasztják a sejt többi részétől, és a membrán citoszolos felületét külső közegnek vagy fürdőnek teszik ki. Ennek a módszernek az egyik előnye, hogy a kísérletező a fürdőn keresztül hozzáfér a membrán intracelluláris felületéhez, és megváltoztathatja a membrán felületének kémiai összetételét. Ez akkor hasznos, ha egy kísérletező manipulálni kívánja a környezetet az egyes ioncsatornák intracelluláris felületén. Például az intracelluláris ligandumok által aktivált csatornákat ezután ligandumkoncentrációk tartományán keresztül lehet tanulmányozni.
az inside-out konfiguráció elérése érdekében a pipettát a sejtmembránhoz rögzítik, mint a sejthez kapcsolt módban, gigasealot képezve, majd visszahúzzák, hogy egy membránfoltot letörjenek a sejt többi részéről. A membrán tapasz lehúzása kezdetben gyakran a membrán vezikulumának kialakulását eredményezi a pipetta hegyében, mivel a tapasz membrán végei a kivágás után gyorsan összeolvadnak. Ezután a vezikulum külső felületét fel kell törni, hogy belülről kifelé LÉPJEN; ezt úgy tehetjük meg, hogy a membránt rövid időre átvesszük a fürdőoldat/levegő interfészen, alacsony Ca2+ oldatnak tesszük ki, vagy pillanatnyilag érintkezésbe kerülünk egy csepp paraffinnal vagy egy darab kikeményedett szilikon polimerrel.
teljes cellás felvétel vagy teljes cellás javítás [szerkesztés]
az egész cellás felvételek magukban foglalják az áramok egyidejű rögzítését több csatornán keresztül, a sejtmembrán nagy részén. Az elektróda a helyén marad a cellán, mint a sejthez csatolt felvételeknél, de több szívást alkalmaznak a membrán tapasz megrepedésére, ezáltal hozzáférést biztosítva a pipetta belsejéből a sejt intracelluláris térébe. Ez lehetőséget ad arra, hogy a kezelések (pl. gyógyszerek) valós időben befolyásolják a sejteket. Miután a pipettát a sejtmembránhoz rögzítették, két módszer létezik a tapasz megtörésére. Az első az, hogy több szívást alkalmazunk. Ennek a szívásnak a mennyisége és időtartama a cella típusától és a pipetta méretétől függ. A másik módszer nagy áramimpulzust igényel a pipettán keresztül. Az alkalmazott áram mennyisége és az impulzus időtartama a cella típusától is függ. Bizonyos típusú sejtek esetében célszerű mindkét módszert egyszerre alkalmazni a tapasz megtörésére.
a teljes cellás patch bilincs felvétel előnye az éles elektróda technikával történő rögzítéssel szemben, hogy a patch bilincs elektróda csúcsán lévő Nagyobb nyílás alacsonyabb ellenállást biztosít, így jobb elektromos hozzáférést biztosít a cella belsejéhez. Ennek a technikának az a hátránya, hogy mivel az elektróda térfogata nagyobb, mint a cella térfogata, a cella belsejének oldható tartalmát lassan felváltja az elektróda tartalma. Ezt nevezik a cella tartalmát “dializáló” elektródának. Egy idő után a sejt minden olyan tulajdonsága megváltozik, amely az oldható intracelluláris tartalomtól függ. Az alkalmazott pipettaoldat általában megközelíti a sejt belsejének magas káliumtartalmú környezetét, hogy minimalizálja az esetleges változásokat. Az egész cellás felvétel elején gyakran van egy időszak, amikor a cella dializációja előtt méréseket lehet végezni.
külső-külső javításszerkesztés
az “Out-out” név hangsúlyozza mind a technika komplementaritását a inside-out technikával, mind azt a tényt, hogy a sejtmembrán külső, nem pedig intracelluláris felületét a membrán tapaszának külső oldalára helyezi, a tapasz elektródához viszonyítva.
a külső javítás kialakulása egy egész cellás rögzítési konfigurációval kezdődik. Az egész cellás konfiguráció kialakulása után az elektróda lassan visszahúzódik a cellából, lehetővé téve a membrán izzójának kiürülését a cellából. Amikor az elektródát elég messzire húzzák, ez a bleb leválik a celláról, és konvex membránként átalakul az elektróda végén (mint egy golyó az elektróda csúcsán nyitva), a membrán eredeti külső része kifelé néz az elektródától. Amint a jobb oldali képen látható, ez azt jelenti, hogy a pipetta belsejében lévő folyadék szimulálja az intracelluláris folyadékot, míg a kutató szabadon mozgathatja a pipettát és a bleb csatornáit egy másik oldatfürdőbe. Míg a membrán blebjében több csatorna is létezhet, ebben a konformációban egycsatornás felvételek is lehetségesek, ha a leválasztott membrán blebje kicsi és csak egy csatornát tartalmaz.
a külső foltozás lehetőséget ad a kísérletezőnek arra, hogy megvizsgálja az ioncsatorna tulajdonságait, amikor a sejtből izolálják, és egymás után különböző oldatoknak vannak kitéve a membrán extracelluláris felületén. A kísérletező viszonylag rövid idő alatt perfúzálhatja ugyanazt a tapaszt különféle oldatokkal, és ha a csatornát egy neurotranszmitter vagy gyógyszer aktiválja az extracelluláris felületről, akkor dózis-válasz görbét lehet elérni. Ez a képesség, hogy pontosan ugyanazon membrándarabon keresztül mérjük az áramot különböző oldatokban, az Out-out tapasz egyértelmű előnye a sejthez kapcsolt módszerhez képest. Másrészt nehezebb megvalósítani. A hosszabb formázási folyamat több lépést foglal magában, amelyek kudarcot vallhatnak, és a használható javítások alacsonyabb gyakoriságát eredményezik.
perforált patchszerkesztés
a patch clamp módszer ezen változata nagyon hasonlít az egész cellás konfigurációhoz. A fő különbség abban rejlik, hogy amikor a kísérletező a gigaohm tömítést képezi, a szívást nem használják a tapaszmembrán felszakítására. Ehelyett az elektródaoldat kis mennyiségű gombaellenes vagy antibiotikus szert, például amfothericin-B-t, nystatint vagy gramicidint tartalmaz, amely diffundál a membrán tapaszába, és kis pórusokat képez a membránban, elektromos hozzáférést biztosítva a sejt belsejéhez. A teljes sejtes és a perforált tapasz módszereinek összehasonlításakor az egész sejtes tapaszra nyitott ajtóként gondolhatunk, amelyben a pipettaoldatban lévő molekulák és a citoplazma teljes cseréje zajlik. A perforált tapasz hasonlítható egy képernyőajtóhoz, amely csak bizonyos molekulák cseréjét teszi lehetővé a pipettaoldatból a sejt citoplazmájába.
a perforált tapasz módszer előnyei a teljes sejtes felvételekhez képest magukban foglalják az antibiotikum pórusainak tulajdonságait, amelyek csak a tapasz pipetta és a citoszol közötti Kis monovalens ionok kiegyensúlyozását teszik lehetővé, de nem a nagyobb molekulák, amelyek nem tudnak áthatolni a pórusokon. Ez a tulajdonság fenntartja a kétértékű ionok, például a Ca2+ endogén szintjét és a jelátviteli molekulákat, például a cAMP. Következésképpen az egész sejt felvételei lehetnek, mint az egész sejtes tapasz befogásakor, miközben megtartják a legtöbb intracelluláris jelátviteli mechanizmust, mint a sejthez csatolt felvételeknél. Ennek eredményeként csökken az áramkimaradás, és a stabil perforált patch felvételek egy óránál tovább tarthatnak. A hátrányok közé tartozik a teljes cellához viszonyított nagyobb hozzáférési ellenállás,mivel az elektróda csúcsát elfoglaló részleges membrán. Ez csökkentheti az aktuális felbontást és növelheti a rögzítési zajt. Jelentős időbe telhet, amíg az antibiotikum perforálja a membránt (körülbelül 15 perc az amfothericin-B esetében, és még hosszabb a gramicidin és a nystatin esetében). Az elektróda csúcsa alatti membránt az antibiotikum által létrehozott perforációk gyengítik, és megrepedhetnek. Ha a tapasz megreped, akkor a felvétel teljes sejtes módban történik, az antibiotikum szennyezi a sejt belsejét.
Laza patchszerkesztés
a laza tapaszbilincs abban különbözik az itt tárgyalt többi technikától, hogy laza tömítést (alacsony elektromos ellenállást) alkalmaz, nem pedig a hagyományos technikában alkalmazott szoros gigasealt. Ezt a technikát már 1961-ben alkalmazták, amint azt Strickholm egy izomsejt felszínének impedanciájáról szóló cikkében leírta, de kevés figyelmet kapott, amíg Almers, Stanfield és St Enterprohmer 1982-ben nevet nem adott, miután a patch clampot az elektrofiziológia egyik fő eszközeként hozták létre.
a sejtmembránon lévő laza tapaszbilincs eléréséhez a pipettát lassan mozgatjuk a cella felé, amíg a cella és a pipetta közötti érintkezés elektromos ellenállása néhányszor nagyobb ellenállásra nem nő, mint önmagában az elektródé. Minél közelebb kerül a pipetta a membránhoz, annál nagyobb lesz a pipetta hegyének ellenállása, de ha túl közel van egy tömítés, akkor nehéz lehet eltávolítani a pipettát a sejt károsítása nélkül. A laza tapasz technikához a pipetta nem kerül elég közel a membránhoz ahhoz, hogy gigaseal vagy állandó kapcsolatot képezzen, sem a sejtmembrán átszúrásához. A sejtmembrán sértetlen marad, és a szoros tömítés hiánya kis rést hoz létre, amelyen keresztül az ionok átjuthatnak a sejten kívül anélkül, hogy belépnének a pipettába.
a laza tömítés jelentős előnye, hogy az alkalmazott pipetta felvétel után ismételten eltávolítható a membránról, és a membrán sértetlen marad. Ez lehetővé teszi az ismételt méréseket ugyanazon a cellán különböző helyeken anélkül, hogy megsemmisítené a membrán integritását. Ez a rugalmasság különösen hasznos volt a kutatók számára az izomsejtek tanulmányozásához, mivel valós fiziológiai körülmények között összehúzódnak, gyorsan megszerzik a felvételeket, és anélkül, hogy drasztikus intézkedéseket alkalmaznának az izomrostok összehúzódásának megakadályozására. Jelentős hátrány, hogy a pipetta és a membrán közötti ellenállás nagymértékben csökken, lehetővé téve az áram szivárgását a tömítésen keresztül, és jelentősen csökkentve a kis áramok felbontását. Ez a szivárgás részben korrigálható, azonban, amely lehetőséget kínál a különböző területekről készült felvételek összehasonlítására és kontrasztjára az érdeklődésre számot tartó cellában. Ezt figyelembe véve becslések szerint a laza tapasz technika 1 mA/cm2-nél kisebb áramokat képes megoldani.