Plusieurs variantes de la technique de base peuvent être appliquées, en fonction de ce que le chercheur souhaite étudier. Les techniques inside-out et outside-out sont appelées techniques de « patch excisé », car le patch est excisé (retiré) du corps principal de la cellule. Les techniques de patch à fixation cellulaire et les deux techniques de patch excisées sont utilisées pour étudier le comportement de canaux ioniques individuels dans la section de membrane attachée à l’électrode.
Le patch de cellule entière et le patch perforé permettent au chercheur d’étudier le comportement électrique de la cellule entière, au lieu de courants à canal unique. Le patch de cellule entière, qui permet un accès électrique à faible résistance à l’intérieur d’une cellule, a maintenant largement remplacé les techniques d’enregistrement de microélectrodes à haute résistance pour enregistrer les courants sur toute la membrane cellulaire.
Patch attaché à une cellule
Pour ce procédé, la pipette est scellée sur la membrane cellulaire pour obtenir un gigaseal, tout en s’assurant que la membrane cellulaire reste intacte. Ceci permet l’enregistrement des courants à travers un ou quelques canaux ioniques contenus dans le patch de membrane capturé par la pipette. En se fixant uniquement à l’extérieur de la membrane cellulaire, il y a très peu de perturbation de la structure cellulaire. De plus, en ne perturbant pas l’intérieur de la cellule, tous les mécanismes intracellulaires influençant normalement le canal pourront toujours fonctionner comme ils le feraient physiologiquement. En utilisant cette méthode, il est également relativement facile d’obtenir la bonne configuration, et une fois obtenue, elle est assez stable.
Pour les canaux ioniques à déclenchement ligand ou les canaux modulés par des récepteurs métabotropes, le neurotransmetteur ou le médicament étudié est généralement inclus dans la solution de pipette, où il peut interagir avec ce qui était autrefois la surface externe de la membrane. L’activité du canal qui en résulte peut être attribuée au médicament utilisé, bien qu’il ne soit généralement pas possible de modifier ensuite la concentration du médicament à l’intérieur de la pipette. La technique est ainsi limitée à un point d’une courbe dose-réponse par patch. Par conséquent, la réponse posologique est réalisée en utilisant plusieurs cellules et patchs. Cependant, les canaux ioniques à déclenchement de tension peuvent être serrés successivement à différents potentiels membranaires dans un seul patch. Il en résulte une activation du canal en fonction de la tension, et une courbe complète I-V (courant-tension) ne peut être établie que dans un seul patch. Un autre inconvénient potentiel de cette technique est que, tout comme les voies intracellulaires de la cellule ne sont pas perturbées, elles ne peuvent pas non plus être directement modifiées.
Patch intérieur-extérieurmodifier
Dans la méthode inside-out, un patch de la membrane est fixé à la pipette patch, détaché du reste de la cellule, et la surface cytosolique de la membrane est exposée au milieu externe, ou bain. Un avantage de cette méthode est que l’expérimentateur a accès à la surface intracellulaire de la membrane via le bain et peut modifier la composition chimique de ce à quoi la surface de la membrane est exposée. Ceci est utile lorsqu’un expérimentateur souhaite manipuler l’environnement à la surface intracellulaire de canaux ioniques uniques. Par exemple, les canaux activés par des ligands intracellulaires peuvent ensuite être étudiés à travers une gamme de concentrations de ligands.
Pour obtenir la configuration inside-out, la pipette est fixée à la membrane cellulaire comme dans le mode attaché à la cellule, formant un gigaseal, puis est rétractée pour rompre un morceau de membrane du reste de la cellule. Le retrait d’un patch membranaire entraîne souvent initialement la formation d’une vésicule de membrane dans la pointe de la pipette, car les extrémités de la membrane du patch fusionnent rapidement après l’excision. La face externe de la vésicule doit alors être ouverte pour entrer en mode intérieur-extérieur; cela peut être fait en faisant passer brièvement la membrane à travers l’interface solution de bain/ air, en l’exposant à une solution à faible teneur en Ca2+, ou en entrant momentanément en contact avec une gouttelette de paraffine ou un morceau de polymère de silicone durci.
Enregistrement de cellules entières ou patch de cellules entièresmodifier
Les enregistrements de cellules entières impliquent d’enregistrer des courants à travers plusieurs canaux simultanément, sur une grande région de la membrane cellulaire. L’électrode est laissée en place sur la cellule, comme dans les enregistrements attachés à la cellule, mais plus d’aspiration est appliquée pour rompre le patch membranaire, permettant ainsi un accès depuis l’intérieur de la pipette à l’espace intracellulaire de la cellule. Cela fournit un moyen d’administrer et d’étudier comment les traitements (par exemple, les médicaments) peuvent affecter les cellules en temps réel. Une fois la pipette fixée à la membrane cellulaire, il existe deux méthodes pour casser le patch. La première consiste à appliquer plus d’aspiration. La quantité et la durée de cette aspiration dépendent du type de cellule et de la taille de la pipette. L’autre méthode nécessite l’envoi d’une grande impulsion de courant à travers la pipette. La quantité de courant appliquée et la durée de l’impulsion dépendent également du type de cellule. Pour certains types de cellules, il est pratique d’appliquer les deux méthodes simultanément pour casser le patch.
L’avantage de l’enregistrement de la pince de raccordement de cellule entière par rapport à l’enregistrement de la technique d’électrode pointue est que la plus grande ouverture à l’extrémité de l’électrode de la pince de raccordement offre une résistance inférieure et donc un meilleur accès électrique à l’intérieur de la cellule. Un inconvénient de cette technique est que le volume de l’électrode étant supérieur au volume de la cellule, le contenu soluble de l’intérieur de la cellule sera lentement remplacé par le contenu de l’électrode. C’est ce qu’on appelle l’électrode « dialysant » le contenu de la cellule. Après un certain temps, toutes les propriétés de la cellule qui dépendent du contenu intracellulaire soluble seront modifiées. La solution de pipette utilisée se rapproche généralement de l’environnement riche en potassium de l’intérieur de la cellule pour minimiser les changements que cela peut causer. Il y a souvent une période au début d’un enregistrement de cellule entière où l’on peut prendre des mesures avant que la cellule n’ait été dialysée.
Patch extérieur-outmodifier
Le nom « outside-out » souligne à la fois la complémentarité de cette technique avec la technique inside-out, et le fait qu’elle place la surface externe plutôt qu’intracellulaire de la membrane cellulaire à l’extérieur du patch de membrane, par rapport à l’électrode du patch.
La formation d’un patch extérieur-extérieur commence par une configuration d’enregistrement de cellule entière. Une fois la configuration de la cellule entière formée, l’électrode est lentement retirée de la cellule, ce qui permet à un bulbe de membrane de sortir de la cellule. Lorsque l’électrode est tirée assez loin, ce bleb se détachera de la cellule et se reformera en membrane convexe à l’extrémité de l’électrode (comme une bille ouverte à la pointe de l’électrode), l’extérieur d’origine de la membrane étant orienté vers l’extérieur de l’électrode. Comme le montre l’image de droite, cela signifie que le fluide à l’intérieur de la pipette simule le liquide intracellulaire, tandis qu’un chercheur est libre de déplacer la pipette et le bleb avec ses canaux vers un autre bain de solution. Alors que plusieurs canaux peuvent exister dans un bleb de membrane, des enregistrements à un seul canal sont également possibles dans cette conformation si le bleb de membrane détachée est petit et ne contient qu’un seul canal.
Le rapiéçage extérieur-extérieur permet à l’expérimentateur d’examiner les propriétés d’un canal ionique lorsqu’il est isolé de la cellule et exposé successivement à différentes solutions sur la surface extracellulaire de la membrane. L’expérimentateur peut perfuser le même patch avec une variété de solutions dans un laps de temps relativement court, et si le canal est activé par un neurotransmetteur ou un médicament à partir de la face extracellulaire, une courbe dose-réponse peut alors être obtenue. Cette capacité à mesurer le courant à travers exactement le même morceau de membrane dans différentes solutions est l’avantage distinct du patch extérieur-extérieur par rapport à la méthode liée à la cellule. D’un autre côté, c’est plus difficile à accomplir. Le processus de formation plus long implique plus d’étapes qui pourraient échouer et se traduit par une fréquence plus faible de patchs utilisables.
Patch perforé
Cette variante de la méthode patch clamp est très similaire à la configuration de la cellule entière. La principale différence réside dans le fait que lorsque l’expérimentateur forme le joint gigaohm, l’aspiration n’est pas utilisée pour rompre la membrane du patch. Au lieu de cela, la solution d’électrode contient de petites quantités d’un agent antifongique ou antibiotique, tel que l’amphothéricine-B, la nystatine ou la gramicidine, qui diffuse dans le patch membranaire et forme de petits pores dans la membrane, fournissant un accès électrique à l’intérieur de la cellule. Lorsque l’on compare les méthodes de la cellule entière et du patch perforé, on peut considérer le patch de la cellule entière comme une porte ouverte, dans laquelle il y a un échange complet entre les molécules de la solution de pipette et le cytoplasme. Le patch perforé peut être assimilé à une porte moustiquaire qui ne permet que l’échange de certaines molécules de la solution de pipette vers le cytoplasme de la cellule.
Les avantages de la méthode du patch perforé, par rapport aux enregistrements de cellules entières, incluent les propriétés des pores antibiotiques, qui ne permettent l’équilibrage que des petits ions monovalents entre la pipette du patch et le cytosol, mais pas des molécules plus grosses qui ne peuvent pas pénétrer à travers les pores. Cette propriété maintient des niveaux endogènes d’ions divalents tels que Ca2+ et de molécules de signalisation telles que l’AMPc. Par conséquent, on peut avoir des enregistrements de la cellule entière, comme dans le serrage du patch de la cellule entière, tout en conservant la plupart des mécanismes de signalisation intracellulaires, comme dans les enregistrements attachés à la cellule. En conséquence, le courant est réduit et les enregistrements de patch perforés stables peuvent durer plus d’une heure. Les inconvénients incluent une résistance d’accès plus élevée, par rapport à la cellule entière, due à la membrane partielle occupant la pointe de l’électrode. Cela peut diminuer la résolution actuelle et augmenter le bruit d’enregistrement. Il peut également prendre un temps important pour que l’antibiotique perfore la membrane (environ 15 minutes pour l’amphothéricine-B, et encore plus longtemps pour la gramicidine et la nystatine). La membrane sous la pointe de l’électrode est affaiblie par les perforations formées par l’antibiotique et peut se rompre. Si le patch se rompt, l’enregistrement est alors en mode cellule entière, l’antibiotique contaminant l’intérieur de la cellule.
Pièce détachéemodifier
La pince à patch lâche est différente des autres techniques discutées ici en ce qu’elle utilise un joint lâche (faible résistance électrique) plutôt que le gigaseal serré utilisé dans la technique conventionnelle. Cette technique a été utilisée dès l’année 1961, comme décrit dans un article de Strickholm sur l’impédance de la surface d’une cellule musculaire, mais a reçu peu d’attention jusqu’à ce qu’elle soit à nouveau évoquée et nommée par Almers, Stanfield et Stühmer en 1982, après que le patch clamp ait été établi comme un outil majeur de l’électrophysiologie.
Pour réaliser une pince de patch lâche sur une membrane cellulaire, la pipette est déplacée lentement vers la cellule, jusqu’à ce que la résistance électrique du contact entre la cellule et la pipette augmente jusqu’à une résistance quelques fois supérieure à celle de l’électrode seule. Plus la pipette se rapproche de la membrane, plus la résistance de la pointe de la pipette augmente, mais si un joint trop étroit se forme, il peut devenir difficile de retirer la pipette sans endommager la cellule. Pour la technique du patch lâche, la pipette ne s’approche pas suffisamment de la membrane pour former une connexion gigaséale ou permanente, ni pour percer la membrane cellulaire. La membrane cellulaire reste intacte et l’absence de joint étanche crée un petit espace à travers lequel les ions peuvent passer à l’extérieur de la cellule sans entrer dans la pipette.
Un avantage significatif du joint desserré est que la pipette utilisée peut être retirée à plusieurs reprises de la membrane après l’enregistrement et que la membrane restera intacte. Cela permet des mesures répétées dans une variété d’endroits sur la même cellule sans détruire l’intégrité de la membrane. Cette flexibilité a été particulièrement utile aux chercheurs pour étudier les cellules musculaires car elles se contractent dans des conditions physiologiques réelles, obtenant des enregistrements rapidement, et ce sans recourir à des mesures drastiques pour empêcher les fibres musculaires de se contracter. Un inconvénient majeur est que la résistance entre la pipette et la membrane est fortement réduite, permettant au courant de fuir à travers le joint, et réduisant considérablement la résolution des petits courants. Cette fuite peut cependant être partiellement corrigée, ce qui offre la possibilité de comparer et de contraster des enregistrements réalisés à partir de différentes zones de la cellule d’intérêt. Compte tenu de cela, il a été estimé que la technique du loose patch peut résoudre des courants inférieurs à 1 mA/cm2.