flere variationer af den grundlæggende teknik kan anvendes, afhængigt af hvad forskeren ønsker at studere. De indvendige og udvendige teknikker kaldes” udskårne patch ” – teknikker, fordi plasteret udskæres (fjernes) fra cellens hovedlegeme. Cellebundet og begge udskårne patchteknikker bruges til at studere adfærden af individuelle ionkanaler i den del af membranen, der er fastgjort til elektroden.
helcelleplaster og perforeret plaster giver forskeren mulighed for at studere den elektriske opførsel af hele cellen i stedet for enkeltkanalstrømme. Hele cellepatchen, som muliggør lav modstand elektrisk adgang til indersiden af en celle, har nu stort set erstattet mikroelektrode-optagelsesteknikker med høj modstand til at registrere strømme over hele cellemembranen.
Cellebundet patchrediger
til denne metode forsegles pipetten på cellemembranen for at opnå en gigaseal, samtidig med at cellemembranen forbliver intakt. Dette tillader registrering af strømme gennem enkelte eller nogle få ionkanaler indeholdt i membranplasteret fanget af pipetten. Ved kun at fastgøre det ydre af cellemembranen er der meget lidt forstyrrelse af cellestrukturen. Ved ikke at forstyrre det indre af cellen vil eventuelle intracellulære mekanismer, der normalt påvirker kanalen, stadig kunne fungere som de ville fysiologisk. Ved hjælp af denne metode er det også relativt let at opnå den rigtige konfiguration, og når den først er opnået, er den ret stabil.
for ligandstyrede ionkanaler eller kanaler, der moduleres af metabotrope receptorer, indgår neurotransmitteren eller lægemidlet, der undersøges, normalt i pipetteopløsningen, hvor det kan interagere med det, der plejede at være membranens ydre overflade. Den resulterende kanalaktivitet kan tilskrives det anvendte lægemiddel, skønt det normalt ikke er muligt derefter at ændre lægemiddelkoncentrationen inde i pipetten. Teknikken er således begrænset til et punkt i en dosisresponskurve pr. Derfor opnås dosisresponset ved anvendelse af flere celler og plastre. Imidlertid kan spændingsstyrede ionkanaler klemmes successivt ved forskellige membranpotentialer i en enkelt patch. Dette resulterer i kanalaktivering som en funktion af spænding, og en komplet i-v (strømspænding) kurve kan kun etableres i en patch. En anden potentiel ulempe ved denne teknik er, at ligesom de intracellulære veje i cellen ikke forstyrres, kan de heller ikke ændres direkte.
indvendig patch
i den indvendige metode er en plaster af membranen fastgjort til plasterpipetten, løsnet fra resten af cellen, og den cytosoliske overflade af membranen udsættes for det eksterne medie eller bad. En fordel ved denne metode er, at eksperimentatoren har adgang til den intracellulære overflade af membranen via badet og kan ændre den kemiske sammensætning af, hvad membranoverfladen udsættes for. Dette er nyttigt, når en eksperimentator ønsker at manipulere miljøet ved den intracellulære overflade af enkelt ionkanaler. For eksempel kan kanaler, der aktiveres af intracellulære ligander, derefter undersøges gennem en række ligandkoncentrationer.
for at opnå den indvendige konfiguration fastgøres pipetten til cellemembranen som i cellebundet tilstand og danner en gigaseal og trækkes derefter tilbage for at afbryde en membranplaster fra resten af cellen. Træk af en membranplaster resulterer ofte oprindeligt i dannelsen af en vesikel af membran i pipettespidsen, fordi enderne af plastermembranen smelter sammen hurtigt efter udskæring. Vesiklens ydre overflade skal derefter brydes åben for at gå ind i indvendig tilstand; dette kan gøres ved kort at tage membranen gennem badopløsningen / luftgrænsefladen, ved udsættelse for en lav Ca2+ – opløsning eller ved øjeblikkeligt at komme i kontakt med en dråbe paraffin eller et stykke hærdet silikonepolymer.
helcelleoptagelse eller hele cellepatchrediger
helcelleoptagelser involverer optagelse af strømme gennem flere kanaler samtidigt over et stort område af cellemembranen. Elektroden efterlades på plads på cellen, som i cellebundne optagelser, men mere sugning påføres for at sprænge membranplasteret, hvilket giver adgang fra det indre af pipetten til det intracellulære rum i cellen. Dette giver et middel til at administrere og studere, hvordan behandlinger (f.eks. Når pipetten er fastgjort til cellemembranen, er der to metoder til at bryde plasteret. Den første er ved at anvende mere sugning. Mængden og varigheden af denne sugning afhænger af typen af celle og størrelsen på pipetten. Den anden metode kræver, at en stor strømpuls sendes gennem pipetten. Hvor meget strøm der anvendes, og pulsens varighed afhænger også af typen af celle. For nogle typer celler er det praktisk at anvende begge metoder samtidigt for at bryde plasteret.
fordelen ved optagelse af patchklemme over optagelse af skarp elektrodeteknik er, at den større åbning ved spidsen af patchklemmeelektroden giver lavere modstand og dermed bedre elektrisk adgang til indersiden af cellen. En ulempe ved denne teknik er, at fordi volumenet af elektroden er større end volumenet af cellen, vil det opløselige indhold af cellens indre langsomt blive erstattet af indholdet af elektroden. Dette kaldes elektroden “dialyserer” cellens indhold. Efter et stykke tid ændres eventuelle egenskaber af cellen, der afhænger af opløseligt intracellulært indhold. Den anvendte pipetteopløsning tilnærmer normalt miljøet med højt kalium i det indre af cellen for at minimere eventuelle ændringer, dette kan medføre. Der er ofte en periode i begyndelsen af en helcelleoptagelse, når man kan tage målinger, før cellen er blevet dialyseret.
Outside-out patchrediger
navnet” outside-out ” understreger både denne tekniks komplementaritet med inside-out-teknikken og det faktum, at den placerer den ydre snarere end intracellulære overflade af cellemembranen på ydersiden af membranplasteret i forhold til patchelektroden.
dannelsen af en ekstern patch begynder med en helcelleoptagelseskonfiguration. Efter at hele cellekonfigurationen er dannet, trækkes elektroden langsomt ud af cellen, hvilket tillader en membranpære at blæse ud fra cellen. Når elektroden trækkes langt nok væk, løsnes denne bleb fra cellen og reformeres som en konveks membran på enden af elektroden (som en kugle åben ved elektrodespidsen), hvor den originale yderside af membranen vender udad fra elektroden. Som billedet til højre viser, betyder det, at væsken inde i pipetten simulerer den intracellulære væske, mens en forsker frit kan flytte pipetten og bleb med sine kanaler til et andet opløsningsbad. Mens flere kanaler kan eksistere i en bleb af membran, enkeltkanaloptagelser er også mulige i denne konformation, hvis bleb af løsrevet membran er lille og kun indeholder en kanal.
udvendig patching giver eksperimentatoren mulighed for at undersøge egenskaberne af en ionkanal, når den isoleres fra cellen og eksponeres successivt for forskellige opløsninger på membranens ekstracellulære overflade. Eksperimentatoren kan perfuse det samme plaster med en række opløsninger på relativt kort tid, og hvis kanalen aktiveres af en neurotransmitter eller et lægemiddel fra det ekstracellulære ansigt, kan der derefter opnås en dosis-responskurve. Denne evne til at måle strøm gennem nøjagtigt det samme stykke membran i forskellige opløsninger er den tydelige fordel ved den udvendige patch i forhold til den cellebundne metode. På den anden side er det sværere at opnå. Den længere dannelsesproces involverer flere trin, der kan mislykkes og resulterer i en lavere frekvens af brugbare patches.
perforeret patchrediger
denne variation af patch clamp-metoden ligner meget hele cellekonfigurationen. Den største forskel ligger i det faktum, at når eksperimentatoren danner gigaohm-tætningen, bruges sugning ikke til at sprænge patchmembranen. I stedet indeholder elektrodeopløsningen små mængder af et antifungalt eller antibiotisk middel, såsom amphothericinb, nystatin eller gramicidin, som diffunderer ind i membranplasteret og danner små porer i membranen, hvilket giver elektrisk adgang til celleindretningen. Når man sammenligner helcelle-og perforerede patchmetoder, kan man tænke på helcelleplaster som en åben dør, hvor der er fuldstændig udveksling mellem molekyler i pipetteopløsningen og cytoplasmaet. Det perforerede plaster kan sammenlignes med en skærmdør, der kun tillader udveksling af visse molekyler fra pipetteopløsningen til cellens cytoplasma.
fordelene ved den perforerede plastermetode i forhold til helcelleoptagelser inkluderer egenskaberne af de antibiotiske porer, der kun tillader ækvilibrering af små monovalente ioner mellem plasterpipetten og cytosolen, men ikke af større molekyler, der ikke kan trænge igennem porerne. Denne egenskab opretholder endogene niveauer af divalente ioner såsom Ca2+ og signalmolekyler såsom cAMP. Følgelig kan man have optagelser af hele cellen, som i fastspænding af hele celler, mens man bevarer de fleste intracellulære signalmekanismer, som i cellebundne optagelser. Som et resultat er der reduceret strømnedgang, og stabile perforerede patchoptagelser kan vare længere end en time. Ulemper indbefatter en højere adgangsmodstand i forhold til helcelle på grund af den delvise membran, der optager elektrodens spids. Dette kan reducere den aktuelle opløsning og øge optagestøj. Det kan også tage en betydelig mængde tid for antibiotika at perforere membranen (ca.15 minutter for amphothericinb, og endnu længere for gramicidin og nystatin). Membranen under elektrodespidsen svækkes af perforeringerne dannet af antibiotikumet og kan sprænge. Hvis plasteret brister, er optagelsen derefter i helcelletilstand, hvor antibiotika forurener indersiden af cellen.
Løs patchrediger
Loose patch clamp er forskellig fra de andre teknikker, der diskuteres her, idet den anvender en løs tætning (lav elektrisk modstand) snarere end den stramme gigaseal, der anvendes i den konventionelle teknik. Denne teknik blev brugt så tidligt som i år 1961, som beskrevet i et papir af Strickholm om impedansen af en muskelcelles overflade, men fik lidt opmærksomhed, indtil den blev opdraget igen og fik et navn af Almers, Stanfield og St. Larghmer i 1982, efter at patch clamp var blevet etableret som et vigtigt redskab til elektrofysiologi.
for at opnå en løs plasterklemme på en cellemembran bevæges pipetten langsomt mod cellen, indtil den elektriske modstand af kontakten mellem cellen og pipetten øges til et par gange større modstand end elektrodens alene. Jo tættere pipetten kommer på membranen, jo større bliver modstanden af pipettespidsen, men hvis der dannes for tæt en tætning, og det kan blive vanskeligt at fjerne pipetten uden at beskadige cellen. Til den løse patch-teknik kommer pipetten ikke tæt nok på membranen til at danne en gigaseal eller en permanent forbindelse eller til at gennembore cellemembranen. Cellemembranen forbliver intakt, og manglen på en tæt tætning skaber et lille hul, gennem hvilket ioner kan passere uden for cellen uden at komme ind i pipetten.
en væsentlig fordel ved den løse tætning er, at den anvendte pipette gentagne gange kan fjernes fra membranen efter optagelse, og membranen forbliver intakt. Dette tillader gentagne målinger på forskellige steder på den samme celle uden at ødelægge membranets integritet. Denne fleksibilitet har været særlig nyttig for forskere til at studere muskelceller, da de kontraherer under reelle fysiologiske forhold, opnår optagelser hurtigt og gør det uden at ty til drastiske foranstaltninger for at stoppe muskelfibrene fra at indgå kontrakt. En stor ulempe er, at modstanden mellem pipetten og membranen reduceres kraftigt, hvilket tillader strøm at lække gennem tætningen og reducerer opløsningen af små strømme markant. Denne lækage kan dog delvist korrigeres for, hvilket giver mulighed for at sammenligne og kontrastoptagelser foretaget fra forskellige områder på cellen af interesse. I betragtning af dette er det blevet estimeret, at den løse patch-teknik kan løse strømme mindre end 1 mA/cm2.