można zastosować kilka odmian podstawowej techniki, w zależności od tego, co badacz chce studiować. Techniki inside-out i outside-out nazywane są technikami „wyciętego plastra”, ponieważ plaster jest wycięty (usunięty) z głównego ciała komórki. Do badania zachowania poszczególnych kanałów jonowych w części membrany przymocowanej do elektrody stosuje się techniki łączone komórkami i obie wycięte plastry.
łata Całokomórkowa i perforowana łata pozwalają badaczowi badać zachowanie elektryczne całej komórki, zamiast prądów jednokanałowych. Łatka z całej komórki, która umożliwia niski opór elektryczny dostęp do wnętrza komórki, w dużej mierze zastąpiła wysokowydajne techniki zapisu mikroelektrodowego w celu rejestrowania prądów w całej błonie komórkowej.
Patchedit dołączony do komórki
w przypadku tej metody, pipeta jest uszczelniona na błonie komórkowej w celu uzyskania gigaseal, zapewniając jednocześnie, że błona komórkowa pozostaje nienaruszona. Pozwala to na rejestrację prądów przez pojedyncze lub kilka kanałów jonowych zawartych w plastrze membrany przechwytywanej przez pipetę. Przyczepiając się tylko do zewnętrznej części błony komórkowej, występuje bardzo niewielkie zaburzenie struktury komórkowej. Ponadto, nie zakłócając wnętrza komórki, wszelkie mechanizmy wewnątrzkomórkowe normalnie wpływające na kanał nadal będą mogły funkcjonować tak, jak fizjologicznie. Za pomocą tej metody jest również stosunkowo łatwo uzyskać odpowiednią konfigurację, a raz uzyskany jest dość stabilny.
w przypadku kanałów jonowych lub kanałów, które są modulowane przez receptory metabotropowe, badany neuroprzekaźnik lub lek jest zwykle zawarty w roztworze pipety, gdzie może oddziaływać z zewnętrzną powierzchnią błony. Otrzymaną aktywność kanału można przypisać używanemu lekowi, chociaż zwykle nie można zmienić stężenia leku w pipecie. Technika ta jest zatem ograniczona do jednego punktu krzywej odpowiedzi na dawkę na plaster. Dlatego odpowiedź na dawkę uzyskuje się za pomocą kilku komórek i plastrów. Jednak kanały jonowe bramkowane napięciem mogą być mocowane kolejno w różnych potencjałach membranowych w jednym łacie. Powoduje to aktywację kanału w funkcji napięcia, a pełna krzywa I-V (prąd-napięcie) może być ustalona tylko w jednym łacie. Inną potencjalną wadą tej techniki jest to, że podobnie jak wewnątrzkomórkowe szlaki komórkowe nie są zaburzone, nie można ich również bezpośrednio modyfikować.
Inside-out patchEdit
w metodzie inside-out, plaster błony jest przymocowany do pipety plastra, odłączony od reszty komórki, a powierzchnia cytozoliczna błony jest wystawiona na działanie zewnętrznych mediów lub kąpieli. Jedną z zalet tej metody jest to, że eksperymentator ma dostęp do wewnątrzkomórkowej powierzchni błony poprzez kąpiel i może zmienić skład chemiczny tego, na co narażona jest powierzchnia błony. Jest to przydatne, gdy eksperymentator chce manipulować środowiskiem na wewnątrzkomórkowej powierzchni pojedynczych kanałów jonowych. Na przykład, kanały, które są aktywowane przez wewnątrzkomórkowe ligandy mogą być następnie badane przez szereg stężeń ligandów.
aby uzyskać konfigurację inside-out, pipeta jest przymocowana do błony komórkowej, tak jak w trybie przyłączonym do komórki, tworząc gigaseal, a następnie jest chowana, aby oderwać plaster błony od reszty komórki. Odrywanie plastra membranowego często skutkuje początkowo utworzeniem pęcherzyka membrany w końcówce pipety, ponieważ końce membrany łatki łączą się szybko po wycięciu. Zewnętrzna powierzchnia pęcherzyka musi zostać otwarta, aby wejść w tryb inside-out; można to zrobić przez krótkotrwałe przepuszczenie membrany przez interfejs roztwór do kąpieli / powietrze, przez wystawienie na działanie niskiego roztworu Ca2+ lub przez Chwilowy kontakt z kroplą parafiny lub kawałkiem utwardzonego polimeru silikonowego.
nagrywanie całych komórek lub patchowanie całych komórek
nagrania Pełnokomórkowe obejmują rejestrowanie prądów przez wiele kanałów jednocześnie, przez duży obszar błony komórkowej. Elektroda pozostaje na miejscu na komórce, tak jak w nagraniach dołączonych do komórki, ale więcej ssania jest stosowane w celu rozerwania plastra membrany, zapewniając w ten sposób dostęp z wnętrza pipety do wewnątrzkomórkowej przestrzeni komórki. Zapewnia to środki do administrowania i badania, w jaki sposób zabiegi (np. leki) mogą wpływać na komórki w czasie rzeczywistym. Po przymocowaniu pipety do błony komórkowej istnieją dwie metody łamania plastra. Pierwszym z nich jest zastosowanie większej ilości ssania. Ilość i czas trwania tego ssania zależy od rodzaju komórki i wielkości pipety. Druga metoda wymaga wysłania przez pipetę dużego impulsu prądowego. Ile prądu jest przyłożony i czas trwania impulsu zależy również od rodzaju komórki. W przypadku niektórych typów komórek wygodne jest jednoczesne stosowanie obu metod w celu złamania plastra.
zaletą nagrywania całokomórkowego zacisku nad ostrym nagrywaniem techniką elektrody jest to, że większy otwór na końcu elektrody zaciskowej zapewnia niższy opór, a tym samym lepszy dostęp elektryczny do wnętrza ogniwa. Wadą tej techniki jest to, że ponieważ objętość elektrody jest większa niż objętość komórki, rozpuszczalna zawartość wnętrza komórki będzie powoli zastępowana zawartością elektrody. Jest to określane jako elektroda „dializująca” zawartość komórki. Po pewnym czasie wszelkie właściwości komórki, które zależą od rozpuszczalnej zawartości wewnątrzkomórkowej, zostaną zmienione. Zastosowany roztwór pipety zwykle odpowiada środowisku o wysokiej zawartości potasu we wnętrzu komórki, aby zminimalizować ewentualne zmiany. Często na początku rejestracji całej komórki pojawia się okres, w którym można wykonać pomiary przed dializą komórki.
Patchedit
nazwa „outside-out” podkreśla zarówno komplementarność tej techniki z techniką inside-out, jak i fakt, że umieszcza ona zewnętrzną, a nie wewnątrzkomórkową powierzchnię błony komórkowej Na Zewnątrz plastra błony, w stosunku do elektrody plastra.
tworzenie łaty zewnętrznej zaczyna się od konfiguracji nagrywania całej komórki. Po utworzeniu konfiguracji całej komórki elektroda jest powoli wycofywana z komórki, umożliwiając wyblaknięcie żarówki membrany z komórki. Gdy elektroda zostanie odciągnięta wystarczająco daleko, ten bleb odłączy się od komórki i przekształci się w wypukłą membranę na końcu elektrody (jak kula otwarta na końcówce elektrody), z oryginalną zewnętrzną częścią membrany skierowaną na zewnątrz od elektrody. Jak pokazuje obraz po prawej stronie, oznacza to, że płyn wewnątrz pipety będzie symulował płyn wewnątrzkomórkowy, podczas gdy badacz może swobodnie przenieść pipetę i pęcherzyk z jego kanałami do innej kąpieli roztworu. Podczas gdy w blebie membrany może istnieć wiele kanałów, nagrania jednokanałowe są również możliwe w tej konformacji, jeśli bleb membrany odłączonej jest mały i zawiera tylko jeden kanał.
łatanie Na Zewnątrz daje eksperymentatorowi możliwość zbadania właściwości kanału jonowego, gdy jest on izolowany od komórki i wystawiany kolejno na działanie różnych roztworów na pozakomórkowej powierzchni błony. Eksperymentator może przepłukać ten sam plaster różnymi roztworami w stosunkowo krótkim czasie, a jeśli kanał jest aktywowany przez neuroprzekaźnik lub lek z pozakomórkowej twarzy, można uzyskać krzywą odpowiedzi dawki. Ta zdolność do pomiaru prądu przez dokładnie ten sam fragment membrany w różnych roztworach jest wyraźną zaletą łaty zewnętrznej w stosunku do metody przyłączonej do komórki. Z drugiej strony jest to trudniejsze do osiągnięcia. Dłuższy proces tworzenia obejmuje więcej kroków, które mogą się nie powieść i skutkuje mniejszą częstotliwością nadających się do użycia plastrów.
perforowany patchEdit
ta odmiana metody patch clamp jest bardzo podobna do konfiguracji całej komórki. Główna różnica polega na tym, że gdy eksperymentator tworzy uszczelkę gigaohm, ssanie nie jest używane do zerwania membrany plastra. Zamiast tego, roztwór elektrody zawiera niewielkie ilości środka przeciwgrzybiczego lub antybiotykowego, takiego jak amfoterycyna-B, nystatyna lub gramicydyna, który dyfunduje do plastra membrany i tworzy małe pory w błonie, zapewniając elektryczny dostęp do wnętrza komórki. Porównując metody plastrów pełnokomórkowych i perforowanych, można myśleć o plastrach pełnokomórkowych jako otwartych drzwiach, w których dochodzi do całkowitej wymiany między cząsteczkami w roztworze pipety a cytoplazmą. Perforowany plaster można porównać do drzwiczki ekranu, która umożliwia jedynie wymianę pewnych cząsteczek z roztworu pipety do cytoplazmy komórki.
zalety metody perforowanej plastra, w porównaniu z zapisami pełnokomórkowymi, obejmują właściwości porów antybiotyku, które pozwalają na równoważenie tylko małych jonów monowalentnych między pipetą plastra a cytozolem, ale nie większych cząsteczek, które nie mogą przenikać przez pory. Ta właściwość utrzymuje endogenne poziomy jonów dwuwartościowych, takich jak Ca2+ i cząsteczek sygnalizacyjnych, takich jak cAMP. W związku z tym można rejestrować całą komórkę, jak w przypadku zaciskania plastra w całej komórce, zachowując większość wewnątrzkomórkowych mechanizmów sygnałowych, jak w nagraniach przyłączonych do komórki. W rezultacie zmniejszone jest zużycie prądu, a stabilne nagrania z perforowanymi łatami mogą trwać dłużej niż godzinę. Wady obejmują większą odporność na dostęp, w stosunku do całej komórki, ze względu na częściową membranę zajmującą końcówkę elektrody. Może to zmniejszyć aktualną rozdzielczość i zwiększyć szum nagrywania. Może również upłynąć sporo czasu, zanim antybiotyk przebije błonę (około 15 minut dla amfoterycyny-B, a nawet dłużej dla gramicydyny i nystatyny). Membrana pod końcówką elektrody jest osłabiona przez perforacje utworzone przez antybiotyk i może pęknąć. Jeśli łata pęknie, nagranie jest w trybie pełnokomórkowym, z antybiotykiem zanieczyszczającym wnętrze komórki.
luźny patchEdit
Loose patch clamp różni się od innych technik omawianych tutaj, ponieważ wykorzystuje luźne uszczelnienie (niski opór elektryczny), a nie ciasny gigaseal stosowany w konwencjonalnej technice. Technika ta została zastosowana już w roku 1961, jak opisano w artykule Strickholma na temat impedancji powierzchni komórki mięśniowej, ale otrzymała niewiele uwagi, dopóki nie została ponownie podniesiona i nadana przez Almersa, Stanfielda i Stühmera w 1982 roku, po tym jak patch clamp został ustanowiony głównym narzędziem elektrofizjologii.
aby uzyskać luźny zacisk na błonie komórkowej, pipetę przesuwa się powoli w kierunku ogniwa, aż opór elektryczny styku między ogniwem a pipetą wzrośnie do kilkukrotnie większego oporu niż opór samej elektrody. Im bliżej pipety do membrany, tym większy opór staje się końcówki pipety, ale jeśli jest zbyt blisko, tworzy się uszczelnienie i może być trudno usunąć pipetę bez uszkodzenia komórki. W przypadku techniki loose patch pipeta nie zbliża się wystarczająco do błony, aby utworzyć gigaseal lub stałe połączenie, ani przebić błonę komórkową. Błona komórkowa pozostaje nienaruszona, a brak szczeliny tworzy niewielką szczelinę, przez którą jony mogą przechodzić na zewnątrz komórki bez wchodzenia do pipety.
istotną zaletą luźnego uszczelnienia jest to, że używana pipeta może być wielokrotnie usuwana z membrany po zarejestrowaniu, a membrana pozostanie nienaruszona. Pozwala to na powtarzanie pomiarów w różnych miejscach na tej samej komórce bez niszczenia integralności błony. Ta elastyczność była szczególnie przydatna dla naukowców do badania komórek mięśniowych, ponieważ kurczą się one w rzeczywistych warunkach fizjologicznych, szybko uzyskując nagrania i robiąc to bez uciekania się do drastycznych środków, aby powstrzymać włókna mięśniowe przed kurczeniem się. Główną wadą jest to, że opór między pipetą a membraną jest znacznie zmniejszony, co pozwala na wyciek prądu przez uszczelnienie i znacznie zmniejsza rozdzielczość małych prądów. Wyciek ten można jednak częściowo skorygować, co daje możliwość porównania i kontrastu nagrań wykonanych z różnych obszarów na interesującej komórce. Biorąc to pod uwagę, oszacowano, że technika loose patch może rozwiązać prądy mniejsze niż 1 mA/cm2.