Diversas variações da técnica básica pode ser aplicada, dependendo do que o pesquisador deseja estudar. As técnicas “inside-out “e” out out out “são chamadas de técnicas “excised patch”, porque o patch é excisado (removido) do corpo principal da célula. As técnicas do adesivo ligado à célula e excisado são usadas para estudar o comportamento de canais iônicos individuais na seção da membrana ligada ao eletrodo.
adesivo de células inteiras e adesivo perfurado permitem ao pesquisador estudar o comportamento elétrico de toda a célula, em vez de correntes de canal único. O sistema de células inteiras, que permite o acesso eléctrico de baixa resistência ao interior de uma célula, substituiu agora amplamente as técnicas de gravação de microelectrode de alta resistência para registar correntes através de toda a membrana celular.
Célula-anexado patchEdit
Para este método, a pipeta é selado para a membrana celular para obter uma gigaseal, assegurando ao mesmo tempo que a membrana da célula permanece intacta. Isto permite o registo de correntes através de canais iónicos únicos, ou alguns, contidos no pedaço de membrana capturado pela pipeta. Ao ligar-se apenas ao exterior da membrana celular, há muito pouca perturbação da estrutura celular. Além disso, ao não interromper o interior da célula, quaisquer mecanismos intracelulares que influenciem normalmente o canal ainda poderão funcionar como funcionariam fisiologicamente. Usando este método é também relativamente fácil obter a configuração certa, e uma vez obtida é bastante estável.
para canais iónicos ligados ou canais modulados por receptores metabotrópicos, o neurotransmissor ou fármaco em estudo é normalmente incluído na solução de pipeta, onde pode interagir com a superfície externa da membrana. A actividade do canal resultante pode ser atribuída à droga que está a ser utilizada, embora normalmente não seja possível alterar a concentração da droga dentro da pipeta. A técnica está, portanto, limitada a um ponto numa curva de resposta à dose por sistema transdérmico. Assim, a resposta à dose é alcançada utilizando várias células e sistemas transdérmicos. No entanto, os canais iónicos de voltagem podem ser fixados sucessivamente em diferentes potenciais de membrana num único sistema. Isto resulta na ativação do canal como uma função da tensão, e uma curva I-V completa (Corrente-tensão) pode ser estabelecida em apenas um patch. Outra desvantagem potencial desta técnica é que, assim como as vias intracelulares da célula não são perturbadas, elas também não podem ser modificadas diretamente.
de Dentro para fora patchEdit
dentro do método, um patch da membrana é anexado para o patch pipeta, isolada do resto da célula, e o cytosolic superfície da membrana é exposta à mídia externa, ou banheira. Uma vantagem deste método é que o experimentador tem acesso à superfície intracelular da membrana através do banho e pode alterar a composição química do que a superfície da membrana é exposta. Isto é útil quando um experimentador deseja manipular o ambiente na superfície intracelular de canais iônicos únicos. Por exemplo, os canais que são ativados por ligantes intracelulares podem então ser estudados através de uma gama de concentrações de ligando.
para atingir a configuração interior-exterior, a pipeta é ligada à membrana celular como no modo ligado à célula, formando uma Gigas, e é então retraída para quebrar um remendo de membrana do resto da célula. A remoção de um sistema de membrana resulta, muitas vezes, inicialmente na formação de uma vesícula de membrana na ponta da pipeta, porque as extremidades da membrana do sistema se fundem rapidamente após a excisão. A face exterior da vesícula deve então ser quebrada para entrar em modo interior-externo.; para o efeito, pode utilizar-se rapidamente a membrana através da solução de banho/interface ar, por exposição a uma solução de Ca2+ baixa ou por contacto momentâneo com uma gota de parafina ou um pedaço de polímero de silicone curado.
célula Inteira de gravação ou de célula inteira patchEdit
Toda célula gravações envolvem a gravação de correntes através de vários canais em simultâneo, através de uma grande região da membrana celular. O eletrodo é deixado no lugar na célula, como em gravações ligadas à célula, mas mais sucção é aplicada para romper o adesivo de membrana, proporcionando assim acesso do interior da pipeta para o espaço intracelular da célula. Isto fornece um meio de administrar e estudar como os tratamentos (por exemplo, medicamentos) podem afetar as células em tempo real. Uma vez que a pipeta está ligada à membrana celular, existem dois métodos de quebrar o sistema. A primeira é aplicando mais sucção. A quantidade e a duração desta sucção dependem do tipo de célula e do tamanho da pipeta. O outro método requer um pulso de corrente grande a ser enviado através da pipeta. A quantidade de corrente aplicada e a duração do pulso também dependem do tipo de célula. Para alguns tipos de células, é conveniente aplicar ambos os métodos simultaneamente para quebrar o patch.
a vantagem da gravação de grampo de adesivo de células inteiras sobre a gravação da técnica de eletrodo agudo é que a maior abertura na ponta do eletrodo Grampo de adesivo fornece menor resistência e, portanto, melhor acesso elétrico para o interior da célula. Uma desvantagem desta técnica é que, como o volume do eletrodo é maior do que o volume da célula, o conteúdo solúvel do interior da célula será lentamente substituído pelo conteúdo do eletrodo. Isto é referido como o eletrodo “dialisando” o conteúdo da célula. Após algum tempo, quaisquer propriedades da célula que dependem do conteúdo intracelular solúvel serão alteradas. A solução de pipeta utilizada normalmente aproxima-se do ambiente de alto potássio do interior da célula para minimizar quaisquer alterações que possam causar. Há muitas vezes um período no início de uma gravação de uma célula inteira quando se pode fazer medições antes da célula ter sido dialisada.
patchEdit exterior
o nome “out-out” enfatiza tanto a complementaridade desta técnica com a técnica inside-out, quanto o fato de que ela coloca a superfície externa e não intracelular da membrana celular no exterior do remendo da membrana, em relação ao eletrodo do remendo.
a formação de um patch externo começa com uma configuração de gravação de células inteiras. Após a formação da configuração de toda a célula, o eletrodo é lentamente retirado da célula, permitindo que uma ampola de membrana bleb para fora da célula. Quando o eletrodo é puxado para longe o suficiente, este bleb vai se separar da célula e se reformar como uma membrana convexa na extremidade do eletrodo (como uma bola aberta na ponta do eletrodo), com o exterior original da membrana voltada para fora do eletrodo. Como mostra a imagem à direita, isto significa que o fluido dentro da pipeta irá simular o fluido intracelular, enquanto um pesquisador está livre para mover a pipeta e o bleb com seus canais para outro banho de solução. Enquanto múltiplos canais podem existir em um bleb de membrana, gravações de um único canal também são possíveis nesta conformação se o bleb de membrana separada é pequeno e contém apenas um canal.O remendo externo dá ao experimentador a oportunidade de examinar as propriedades de um canal iônico quando ele é isolado da célula e exposto sucessivamente a diferentes soluções na superfície extracelular da membrana. O experimentador pode perfurar o mesmo adesivo com uma variedade de soluções em uma quantidade relativamente curta de tempo, e se o canal é ativado por um neurotransmissor ou fármaco a partir da face extracelular, uma curva de dose-resposta pode então ser obtida. Esta capacidade de medir a corrente exactamente através da mesma peça de membrana em diferentes soluções é a vantagem distinta do remendo externo em relação ao método ligado à célula. Por outro lado, é mais difícil de realizar. O processo de formação mais longo envolve mais passos que poderiam falhar e resulta em uma menor frequência de patches utilizáveis.
Perfuradas patchEdit
Esta variação do patch clamp método é muito semelhante ao todo-configuração da célula. A principal diferença reside no fato de que quando o experimentador forma o selo gigaohm, sucção não é usada para romper a membrana do adesivo. Em vez disso, a solução de eléctrodo contém pequenas quantidades de um agente antifúngico ou antibiótico, tais como anfotericina-B, nistatina ou gramicidina, que se difunde no sistema de membrana e forma pequenos poros na membrana, proporcionando acesso eléctrico ao interior da célula. Ao comparar os métodos do sistema transdérmico de células inteiras e perfurado, pode-se pensar no sistema transdérmico de células inteiras como uma porta aberta, na qual existe uma troca completa entre moléculas na solução da pipeta e o citoplasma. O adesivo perfurado pode ser comparado a uma porta de ecrã que apenas permite a troca de certas moléculas da solução de pipeta para o citoplasma da célula.
as vantagens do método do adesivo perfurado, em relação às gravações de células inteiras, incluem as propriedades dos poros antibióticos, que permitem apenas o equilíbrio de pequenos iões monovalentes entre a pipeta do adesivo e o citosol, mas não de moléculas maiores que não podem permear através dos poros. Esta propriedade mantém níveis endógenos de íons divalentes como Ca2+ e moléculas sinalizadoras como cAMP. Consequentemente, pode-se ter gravações de toda a célula, como no patch da célula inteira, mantendo a maioria dos mecanismos de sinalização intracelular, como nas gravações ligadas à célula. Como resultado, há uma redução do tempo de funcionamento actual, e os registos estáveis perfurados dos sistemas transdérmicos podem durar mais de uma hora. As desvantagens incluem uma maior resistência ao acesso, em relação à célula inteira, devido à membrana parcial ocupando a ponta do eletrodo. Isso pode diminuir a resolução atual e aumentar a gravação de ruído. Pode também levar uma quantidade significativa de tempo para o antibiótico perfurar a membrana (cerca de 15 minutos para a anfotericina-B, e ainda mais para a gramicidina e a nistatina). A membrana sob a ponta do eletrodo é enfraquecida pelas perfurações formadas pelo antibiótico e pode romper. Se o adesivo romper, a gravação é então em modo célula inteira, com antibiótico contaminando o interior da célula.
Solta patchEdit
Solta patch clamp é diferente de outras técnicas discutidas aqui, em que ele emprega um frouxo de vedação (baixa resistência elétrica), ao invés de incluir apertado gigaseal utilizado na técnica convencional. Esta técnica foi utilizada desde o ano de 1961, como descrito em um artigo de Strickholm sobre a impedância de um músculo superfície da célula, mas recebeu pouca atenção até ser trazido de novo e recebe um nome pelo Almers, Stanfield, e Stühmer em 1982, depois de patch clamp, havia sido estabelecida como uma das principais ferramentas de eletrofisiologia.
para obter um grampo solto sobre uma membrana celular, a pipeta é movida lentamente para a célula, até que a resistência eléctrica do contacto entre a célula e a pipeta aumente para algumas vezes maior resistência do que a do eléctrodo isoladamente. Quanto mais próxima a pipeta se aproximar da membrana, maior a resistência da ponta da pipeta, mas se se formar um selo demasiado fechado, poderá tornar-se difícil remover a pipeta sem danificar a célula. Para a técnica do adesivo solto, a pipeta não se aproxima o suficiente da membrana para formar uma ligação gigaseal ou permanente, nem para perfurar a membrana celular. A membrana celular permanece intacta, e a falta de um selo apertado cria uma pequena abertura através da qual iões podem passar para fora da célula sem entrar na pipeta.
uma vantagem significativa do selo solto é que a pipeta utilizada pode ser removida repetidamente da membrana após gravação, e a membrana permanecerá intacta. Isso permite medições repetidas em uma variedade de locais na mesma célula sem destruir a integridade da membrana. Esta flexibilidade tem sido especialmente útil para os pesquisadores para estudar as células musculares como eles se contraiem sob condições fisiológicas reais, obtendo gravações rapidamente, e fazendo isso sem recorrer a medidas drásticas para parar as fibras musculares de contrair. Uma grande desvantagem é que a resistência entre a pipeta e a membrana é muito reduzida, permitindo que a corrente vaze através do selo, e reduzindo significativamente a resolução de pequenas correntes. Esta fuga pode ser parcialmente corrigida para, no entanto, que oferece a oportunidade de comparar e contrastar gravações feitas de diferentes áreas na célula de interesse. Tendo em conta este facto, estimou-se que a técnica de remendo solto pode resolver correntes inferiores a 1 mA/cm2.