flera variationer av grundtekniken kan tillämpas, beroende på vad forskaren vill studera. Inside-out och outside-out tekniker kallas” excised patch ” tekniker, eftersom plåstret skärs ut (avlägsnas) från huvuddelen av cellen. Cellfäst och båda utskurna plåstertekniker används för att studera beteendet hos enskilda jonkanaler i sektionen av membran fäst vid elektroden.
Helcellsplåster och perforerad plåster gör det möjligt för forskaren att studera hela cellens elektriska beteende istället för enkanalströmmar. Hela cellplåstret, som möjliggör elektrisk åtkomst med låg resistans till insidan av en cell, har nu till stor del ersatt mikroelektrodinspelningstekniker med hög resistans för att registrera strömmar över hela cellmembranet.
cell-fäst patchredigera
för denna metod förseglas pipetten på cellmembranet för att erhålla en gigaseal, samtidigt som cellmembranet förblir intakt. Detta möjliggör inspelning av strömmar genom enstaka eller några jonkanaler som finns i plåstret av membran som fångas av pipetten. Genom att bara fästa på utsidan av cellmembranet är det mycket liten störning av cellstrukturen. Genom att inte störa cellens inre kommer alla intracellulära mekanismer som normalt påverkar kanalen fortfarande att kunna fungera som de skulle fysiologiskt. Med hjälp av denna metod är det också relativt lätt att få rätt konfiguration, och när den erhållits är den ganska stabil.
för ligand-gated jonkanaler eller kanaler som moduleras av metabotropa receptorer ingår neurotransmittorn eller läkemedlet som studeras vanligtvis i pipettlösningen, där det kan interagera med vad som brukade vara membranets yttre yta. Den resulterande kanalaktiviteten kan hänföras till läkemedlet som används, även om det vanligtvis inte är möjligt att sedan ändra läkemedelskoncentrationen inuti pipetten. Tekniken är således begränsad till en punkt i en dosresponskurva per plåster. Därför uppnås dosresponsen med användning av flera celler och fläckar. Emellertid kan spänningsgrindade jonkanaler klämmas fast successivt vid olika membranpotentialer i en enda lapp. Detta resulterar i kanalaktivering som en funktion av spänning, och en komplett I-V (strömspänning) kurva kan etableras i endast en patch. En annan potentiell nackdel med denna teknik är att, precis som cellens intracellulära vägar inte störs, kan de inte heller modifieras direkt.
inre och yttre patchredigera
i inside-out-metoden är en lapp av membranet fäst vid plåsterpipetten, lossad från resten av cellen, och membranets cytosoliska yta utsätts för det yttre mediet eller badet. En fördel med denna metod är att experimenteraren har tillgång till membranets intracellulära yta via badet och kan ändra den kemiska sammansättningen av vad membranets yta utsätts för. Detta är användbart när en experimenterare vill manipulera miljön vid den intracellulära ytan av enstaka jonkanaler. Till exempel kan kanaler som aktiveras av intracellulära ligander sedan studeras genom ett intervall av ligandkoncentrationer.
för att uppnå inside-out-konfigurationen är pipetten fäst vid cellmembranet som i cellfäst läge och bildar en gigaseal och dras sedan tillbaka för att bryta av en membranfläck från resten av cellen. Att dra av en membranplåster resulterar ofta initialt i bildandet av en vesikel av membran i pipettspetsen, eftersom ändarna på plåstermembranet smälter samman snabbt efter excision. Vesikelns yttre yta måste sedan brytas upp för att gå in i in-och utläge; detta kan göras genom att kort ta membranet genom badlösningen / luftgränssnittet, genom exponering för en låg Ca2+ – lösning eller genom att tillfälligt komma i kontakt med en droppe paraffin eller en bit härdad silikonpolymer.
inspelning av hela celler eller patchredigera
hela cellinspelningar involverar inspelningsströmmar genom flera kanaler samtidigt, över en stor region av cellmembranet. Elektroden lämnas på plats på cellen, som i cellfästa inspelningar, men mer sug appliceras för att brista membranplåstret, vilket ger åtkomst från pipettens inre till cellens intracellulära utrymme. Detta ger ett sätt att administrera och studera hur behandlingar (t.ex. läkemedel) kan påverka celler i realtid. När pipetten är fäst vid cellmembranet finns det två metoder för att bryta plåstret. Den första är genom att applicera mer sug. Mängden och varaktigheten av denna sugning beror på typen av cell och storleken på pipetten. Den andra metoden kräver att en stor strömpuls skickas genom pipetten. Hur mycket ström som appliceras och pulsens varaktighet beror också på typen av cell. För vissa typer av celler är det lämpligt att tillämpa båda metoderna samtidigt för att bryta plåstret.
fördelen med inspelning av helcellsplåster över inspelning av skarp elektrodteknik är att den större öppningen vid spetsen av plåsterklämelektroden ger lägre motstånd och därmed bättre elektrisk åtkomst till cellens insida. En nackdel med denna teknik är att eftersom elektrodens volym är större än cellens volym, kommer det lösliga innehållet i cellens inre långsamt att ersättas av elektrodens innehåll. Detta kallas elektroden” dialyserar ” cellens innehåll. Efter ett tag kommer alla egenskaper hos cellen som beror på lösligt intracellulärt innehåll att förändras. Den använda pipettlösningen approximerar vanligtvis den höga kaliummiljön i cellens inre för att minimera eventuella förändringar som detta kan orsaka. Det finns ofta en period i början av en helcellsinspelning när man kan göra mätningar innan cellen har dialyserats.
utanför-ut patchredigera
namnet” outside-out ” betonar både denna tekniks komplementaritet med inside-out-tekniken och det faktum att den placerar den yttre snarare än intracellulära ytan av cellmembranet på utsidan av membranplåstret, i förhållande till plåstelektroden.
bildandet av en utvändig patch börjar med en helcellsinspelningskonfiguration. Efter att helcellskonfigurationen har bildats dras elektroden långsamt ut från cellen, vilket gör att en membranlampa kan blöda ut från cellen. När elektroden dras tillräckligt långt bort kommer denna bleb att lossna från cellen och reformeras som ett konvext membran på elektrodens ände (som en boll öppen vid elektrodspetsen), med den ursprungliga utsidan av membranet vänd utåt från elektroden. Som bilden till höger visar betyder detta att vätskan inuti pipetten kommer att simulera den intracellulära vätskan, medan en forskare är fri att flytta pipetten och bleben med sina kanaler till ett annat bad av lösning. Medan flera kanaler kan existera i en membranbleb, enstaka kanalinspelningar är också möjliga i denna konformation om bleb av fristående membran är liten och endast innehåller en kanal.
utvändig patchning ger experimenteraren möjlighet att undersöka egenskaperna hos en jonkanal när den isoleras från cellen och exponeras successivt för olika lösningar på membranets extracellulära yta. Experimenteraren kan perfusera samma lapp med en mängd olika lösningar på relativt kort tid, och om kanalen aktiveras av en neurotransmittor eller ett läkemedel från det extracellulära ansiktet, kan en dos-responskurva erhållas. Denna förmåga att mäta ström genom exakt samma membranstycke i olika lösningar är den tydliga fördelen med utvändig patch i förhållande till den cellfästa metoden. Å andra sidan är det svårare att uppnå. Den längre bildningsprocessen innebär fler steg som kan misslyckas och resulterar i en lägre frekvens av användbara fläckar.
perforerad patchredigera
denna variation av patch clamp-metoden är mycket lik helcellskonfigurationen. Huvudskillnaden ligger i det faktum att när experimenten bildar gigaohm-tätningen, används inte sugning för att brista patchmembranet. Istället innehåller elektrodlösningen små mängder av ett svampdödande eller antibiotikum, såsom amfotericin-B, nystatin eller gramicidin, som diffunderar in i membranplåstret och bildar små porer i membranet, vilket ger elektrisk åtkomst till cellens inre. Vid jämförelse av helcell-och perforerade plåstermetoder kan man tänka på helcellsplåstret som en öppen dörr, där det finns fullständigt utbyte mellan molekyler i pipettlösningen och cytoplasman. Den perforerade plåstret kan liknas vid en skärmdörr som endast tillåter utbyte av vissa molekyler från pipettlösningen till cellens cytoplasma.
fördelar med den perforerade plåstermetoden, i förhållande till helcellsinspelningar, inkluderar egenskaperna hos de antibiotiska porerna, som endast tillåter jämvikt av små monovalenta joner mellan plåsterpipetten och cytosolen, men inte av större molekyler som inte kan tränga igenom porerna. Denna egenskap upprätthåller endogena nivåer av divalenta joner såsom Ca2+ och signalmolekyler såsom cAMP. Följaktligen kan man ha inspelningar av hela cellen, som i helcellsplåsterklämning, samtidigt som man behåller de flesta intracellulära signalmekanismer, som i cellfästa inspelningar. Som ett resultat, det är reducerad ström rundown, och stabila perforerade patch inspelningar kan pågå längre än en timme. Nackdelar innefattar ett högre åtkomstmotstånd, relativt helcell, på grund av det partiella membranet som upptar elektrodens spets. Detta kan minska nuvarande upplösning och öka inspelningsbruset. Det kan också ta en betydande tid för antibiotikumet att perforera membranet (cirka 15 minuter för amfotericin-B, och ännu längre för gramicidin och nystatin). Membranet under elektrodspetsen försvagas av perforeringarna som bildas av antibiotikumet och kan brista. Om plåstret brister, inspelningen är då i helcellsläge, med antibiotikum som förorenar insidan av cellen.
Lös patchredigera
Loose patch clamp skiljer sig från de andra teknikerna som diskuteras här genom att den använder en lös tätning (lågt elektriskt motstånd) snarare än den täta gigasealen som används i den konventionella tekniken. Denna teknik användes så tidigt som år 1961, som beskrivs i ett papper av Strickholm om impedansen hos en muskelcellsyta, men fick liten uppmärksamhet tills den togs upp igen och fick ett namn av Almers, Stanfield och St exceptional 1982, efter att patch clamp hade etablerats som ett viktigt verktyg för elektrofysiologi.
för att uppnå en lös plåsterklämma på ett cellmembran flyttas pipetten långsamt mot cellen tills det elektriska motståndet i kontakten mellan cellen och pipetten ökar till några gånger större motstånd än den för elektroden ensam. Ju närmare pipetten kommer till membranet, desto större blir motståndet hos pipettspetsen, men om för nära bildas en tätning och det kan bli svårt att ta bort pipetten utan att skada cellen. För den lösa plåstertekniken kommer pipetten inte tillräckligt nära membranet för att bilda en gigaseal eller en permanent anslutning eller för att genomborra cellmembranet. Cellmembranet förblir intakt, och bristen på en tät tätning skapar ett litet gap genom vilket joner kan passera utanför cellen utan att komma in i pipetten.
en betydande fördel med den lösa tätningen är att pipetten som används kan tas bort upprepade gånger från membranet efter inspelning och membranet förblir intakt. Detta möjliggör upprepade mätningar på olika platser på samma cell utan att förstöra membranets integritet. Denna flexibilitet har varit särskilt användbar för forskare för att studera muskelceller när de kontraherar under verkliga fysiologiska förhållanden, får inspelningar snabbt och gör det utan att tillgripa drastiska åtgärder för att stoppa muskelfibrerna från att komma i kontakt. En stor nackdel är att motståndet mellan pipetten och membranet reduceras kraftigt, vilket gör att strömmen kan läcka genom tätningen och signifikant minskar upplösningen av små strömmar. Detta läckage kan dock delvis korrigeras för vilket ger möjlighet att jämföra och kontrastera inspelningar gjorda från olika områden på cellen av intresse. Med tanke på detta har det uppskattats att den lösa patchtekniken kan lösa strömmar mindre än 1 mA/cm2.