se pot aplica mai multe variante ale tehnicii de bază, în funcție de ceea ce cercetătorul dorește să studieze. Tehnicile inside-out și Out-out sunt numite tehnici de „plasture excizat”, deoarece plasturele este excizat (îndepărtat) din corpul principal al celulei. Cell-attached și ambele tehnici de patch-uri excizate sunt utilizate pentru a studia comportamentul canalelor ionice individuale în secțiunea membranei atașate la electrod.
plasturele cu celule întregi și plasturele perforat permit cercetătorului să studieze comportamentul electric al întregii celule, în loc de curenți cu un singur canal. Plasturele cu celule întregi, care permite accesul electric cu rezistență scăzută în interiorul unei celule, a înlocuit acum în mare măsură tehnicile de înregistrare cu microelectrozi cu rezistență ridicată pentru a înregistra curenții pe întreaga membrană celulară.
patch atașat de Celulămodificare
pentru această metodă, pipeta este sigilată pe membrana celulară pentru a obține un gigaseal, asigurându-se în același timp că membrana celulară rămâne intactă. Acest lucru permite înregistrarea curenților prin canale ionice unice sau câteva conținute în plasturele de membrană capturat de pipetă. Prin atașarea numai la exteriorul membranei celulare, există foarte puține perturbări ale structurii celulare. De asemenea, prin faptul că nu perturbă interiorul celulei, orice mecanisme intracelulare care influențează în mod normal canalul vor putea funcționa în continuare așa cum ar fi fiziologic. Folosind această metodă este, de asemenea, relativ ușor să se obțină configurația corectă și, odată obținută, este destul de stabilă.
pentru canalele ionice cu ligand sau canalele care sunt modulate de receptorii metabotropici, neurotransmițătorul sau medicamentul studiat este de obicei inclus în soluția de pipetă, unde poate interacționa cu ceea ce a fost suprafața exterioară a membranei. Activitatea canalului rezultat poate fi atribuită medicamentului utilizat, deși de obicei nu este posibilă modificarea concentrației medicamentului în interiorul pipetei. Prin urmare, tehnica este limitată la un punct dintr-o curbă a răspunsului la doză per plasture. Prin urmare, răspunsul la doză este realizat folosind mai multe celule și plasturi. Cu toate acestea, canalele ionice cu tensiune pot fi fixate succesiv la diferite potențiale ale membranei într-un singur plasture. Acest lucru are ca rezultat activarea canalului în funcție de tensiune și o curbă completă I-V (curent-tensiune) poate fi stabilită într-un singur plasture. Un alt dezavantaj potențial al acestei tehnici este că, la fel cum căile intracelulare ale celulei nu sunt perturbate, nici ele nu pot fi modificate direct.
patch interior-exterior
în metoda inside-out, un plasture al membranei este atașat la pipeta plasturelui, detașat de restul celulei, iar suprafața citosolică a membranei este expusă mediului extern sau băii. Un avantaj al acestei metode este că experimentatorul are acces la suprafața intracelulară a membranei prin baie și poate schimba compoziția chimică a ceea ce este expusă suprafeței membranei. Acest lucru este util atunci când un experimentator dorește să manipuleze mediul la suprafața intracelulară a canalelor ionice unice. De exemplu, canalele care sunt activate de liganzi intracelulari pot fi apoi studiate printr-o serie de concentrații de ligand.
pentru a realiza configurația interior-exterior, pipeta este atașată la membrana celulară ca în modul atașat celular, formând un gigaseal și apoi este retrasă pentru a rupe un plasture de membrană din restul celulei. Scoaterea unui plasture de membrană duce adesea inițial la formarea unei vezicule de membrană în vârful pipetei, deoarece capetele membranei de plasture fuzionează rapid după excizie. Fața exterioară a veziculei trebuie apoi spartă pentru a intra în modul interior-exterior; acest lucru se poate face prin trecerea scurtă a membranei prin soluția de baie/interfața de aer, prin expunerea la o soluție scăzută de Ca2+ sau prin contactul momentan cu o picătură de parafină sau o bucată de polimer siliconic întărit.
înregistrare cu celule întregi sau patch cu celule întregi
înregistrările cu celule întregi implică înregistrarea curenților prin mai multe canale simultan, pe o regiune mare a membranei celulare. Electrodul este lăsat pe loc pe celulă, ca în înregistrările atașate de celule, dar se aplică mai multă aspirație pentru a rupe plasturele membranei, oferind astfel acces din interiorul pipetei la spațiul intracelular al celulei. Aceasta oferă un mijloc de a administra și de a studia modul în care tratamentele (de exemplu, medicamentele) pot afecta celulele în timp real. Odată ce pipeta este atașată la membrana celulară, există două metode de rupere a plasturelui. Primul este prin aplicarea mai multă aspirație. Cantitatea și durata acestei aspirații depind de tipul de celulă și dimensiunea pipetei. Cealaltă metodă necesită trimiterea unui impuls de curent mare prin pipetă. Cât de mult curent este aplicat și durata impulsului depind, de asemenea, de tipul de celulă. Pentru unele tipuri de celule, este convenabil să aplicați simultan ambele metode pentru a rupe plasturele.
avantajul înregistrării clemei de patch-uri cu celule întregi față de înregistrarea tehnicii electrodului ascuțit este că deschiderea mai mare de la vârful electrodului de clemă de patch-uri oferă o rezistență mai mică și, prin urmare, un acces electric mai bun la interiorul celulei. Un dezavantaj al acestei tehnici este că, deoarece volumul electrodului este mai mare decât volumul celulei, conținutul solubil din interiorul celulei va fi înlocuit încet cu conținutul electrodului. Acesta este denumit electrodul care „dializează” conținutul celulei. După un timp, orice proprietăți ale celulei care depind de conținutul intracelular solubil vor fi modificate. Soluția de pipetă utilizată aproximează de obicei mediul bogat în potasiu din interiorul celulei pentru a minimiza orice modificări pe care le poate provoca. Există adesea o perioadă la începutul unei înregistrări cu celule întregi, când se pot efectua măsurători înainte ca celula să fie dializată.
patch-uri exterioare
denumirea „outside-out” subliniază atât complementaritatea acestei tehnici cu tehnica inside-out, cât și faptul că plasează suprafața externă mai degrabă decât intracelulară a membranei celulare pe exteriorul plasturelui membranei, în raport cu electrodul plasture.
formarea unui patch exterior-exterior începe cu o configurație de înregistrare a celulelor întregi. După ce se formează configurația întregii celule, electrodul este retras încet din celulă, permițând unui bulb de membrană să iasă din celulă. Când electrodul este tras suficient de departe, acest bleb se va detașa de celulă și se va reforma ca o membrană convexă la capătul electrodului (ca o bilă deschisă la vârful electrodului), cu exteriorul original al membranei orientat spre exterior de electrod. După cum arată imaginea din dreapta, aceasta înseamnă că lichidul din pipetă va simula fluidul intracelular, în timp ce un cercetător este liber să mute pipeta și blebul cu canalele sale într-o altă baie de soluție. În timp ce mai multe canale pot exista într-o bleb de membrană, înregistrările cu un singur canal sunt, de asemenea, posibile în această conformație dacă bleb de membrană detașată este mică și conține doar un singur canal.
patch-ul exterior oferă experimentatorului posibilitatea de a examina proprietățile unui canal ionic atunci când este izolat de celulă și expus succesiv la diferite soluții de pe suprafața extracelulară a membranei. Experimentatorul poate perfuza același plasture cu o varietate de soluții într-un timp relativ scurt și, dacă canalul este activat de un neurotransmițător sau medicament de pe fața extracelulară, se poate obține apoi o curbă doză-răspuns. Această capacitate de a măsura curentul prin exact aceeași bucată de membrană în soluții diferite este avantajul distinct al plasturelui exterior în raport cu metoda atașată celular. Pe de altă parte, este mai dificil de realizat. Procesul de formare mai lung implică mai mulți pași care ar putea eșua și are ca rezultat o frecvență mai mică a patch-urilor utilizabile.
plasture perforat
această variație a metodei clemei de patch-uri este foarte asemănătoare cu configurația întregii celule. Principala diferență constă în faptul că atunci când experimentatorul formează sigiliul gigaohm, aspirația nu este utilizată pentru a rupe membrana plasturelui. În schimb, soluția de electrod conține cantități mici de agent antifungic sau antibiotic, cum ar fi amfotericina-B, Nistatina sau gramicidina, care difuzează în plasturele membranei și formează pori mici în membrană, oferind acces electric la interiorul celulei. Atunci când se compară metodele de plasture cu celule întregi și perforate, se poate gândi la plasturele cu celule întregi ca la o ușă deschisă, în care există un schimb complet între moleculele din soluția de pipetă și citoplasmă. Plasturele perforat poate fi asemănat cu o ușă de ecran care permite doar schimbul anumitor molecule de la soluția de pipetă la citoplasma celulei.
avantajele metodei plasturelui perforat, în raport cu înregistrările cu celule întregi, includ proprietățile porilor antibiotici, care permit echilibrarea doar a ionilor monovalenți mici între pipeta plasturelui și citosol, dar nu și a moleculelor mai mari care nu pot pătrunde prin pori. Această proprietate menține niveluri endogene de ioni bivalenți, cum ar fi Ca2+ și molecule de semnalizare, cum ar fi cAMP. În consecință, se pot avea înregistrări ale întregii celule, ca în prinderea patch-urilor cu celule întregi, păstrând în același timp majoritatea mecanismelor de semnalizare intracelulară, ca în înregistrările atașate de celule. Drept urmare, există o reducere a curentului, iar înregistrările stabile de patch-uri perforate pot dura mai mult de o oră. Dezavantajele includ o rezistență de acces mai mare, în raport cu celula întreagă, datorită membranei parțiale care ocupă vârful electrodului. Aceasta poate reduce rezoluția curentă și poate crește zgomotul de înregistrare. De asemenea, poate dura o perioadă semnificativă de timp pentru ca antibioticul să perforeze membrana (aproximativ 15 minute pentru amfotericină-B și chiar mai mult pentru gramicidină și nistatină). Membrana sub vârful electrodului este slăbită de perforațiile formate de antibiotic și se poate rupe. Dacă plasturele se rupe, înregistrarea este apoi în modul cu celule întregi, antibioticul contaminând interiorul celulei.
Patch Libermodificare
clema de plasture liberă este diferită de celelalte tehnici discutate aici prin faptul că folosește o etanșare liberă (rezistență electrică scăzută), mai degrabă decât gigaseala strânsă utilizată în tehnica convențională. Această tehnică a fost folosită încă din anul 1961, așa cum este descris într-o lucrare de Strickholm pe impedanța suprafeței unei celule musculare, dar a primit puțină atenție până când a fost crescută din nou și a primit un nume de Almers, Stanfield și St.
pentru a obține o clemă de plasture liberă pe o membrană celulară, pipeta este deplasată încet spre celulă, până când rezistența electrică a contactului dintre celulă și pipetă crește la o rezistență de câteva ori mai mare decât cea a electrodului singur. Cu cât pipeta ajunge mai aproape de membrană, cu atât rezistența vârfului pipetei devine mai mare, dar dacă se formează o etanșare prea aproape și ar putea deveni dificilă îndepărtarea pipetei fără a deteriora celula. Pentru tehnica plasturelui liber, pipeta nu se apropie suficient de mult de membrană pentru a forma o conexiune gigaseală sau permanentă și nici pentru a străpunge membrana celulară. Membrana celulară rămâne intactă, iar lipsa unei etanșări strânse creează un mic spațiu prin care ionii pot trece în afara celulei fără a intra în pipetă.
un avantaj semnificativ al sigiliului liber este că pipeta utilizată poate fi îndepărtată în mod repetat din membrană după înregistrare, iar membrana va rămâne intactă. Acest lucru permite măsurători repetate într-o varietate de locații pe aceeași celulă fără a distruge integritatea membranei. Această flexibilitate a fost utilă în special cercetătorilor pentru studierea celulelor musculare, deoarece acestea se contractă în condiții fiziologice reale, obținând înregistrări rapid și făcând acest lucru fără a recurge la măsuri drastice pentru a opri contractarea fibrelor musculare. Un dezavantaj major este că rezistența dintre pipetă și membrană este mult redusă, permițând scurgerea curentului prin etanșare și reducând semnificativ rezoluția curenților mici. Această scurgere poate fi corectată parțial pentru, totuși, ceea ce oferă posibilitatea de a compara și de a contrasta înregistrările realizate din diferite zone ale celulei de interes. Având în vedere acest lucru, s-a estimat că tehnica patch-urilor libere poate rezolva curenți mai mici de 1 mA/cm2.