Se pueden aplicar varias variaciones de la técnica básica, dependiendo de lo que el investigador quiera estudiar. Las técnicas de adentro hacia afuera y afuera hacia afuera se denominan técnicas de «parche extirpado», porque el parche se extirpa (retira) del cuerpo principal de la célula. Las técnicas de parche unido a células y ambas extirpadas se utilizan para estudiar el comportamiento de los canales iónicos individuales en la sección de membrana unida al electrodo.
El parche de célula completa y el parche perforado permiten al investigador estudiar el comportamiento eléctrico de toda la célula, en lugar de las corrientes de un solo canal. El parche de célula completa, que permite el acceso eléctrico de baja resistencia al interior de una célula, ha reemplazado en gran medida las técnicas de registro de microelectrodos de alta resistencia para registrar las corrientes a través de toda la membrana celular.
Parche conectado a la celdaeditar
Para este método, la pipeta se sella en la membrana celular para obtener un gigaseal, asegurando que la membrana celular permanezca intacta. Esto permite el registro de corrientes a través de uno o varios canales iónicos contenidos en el parche de membrana capturado por la pipeta. Al unirse solo al exterior de la membrana celular, hay muy poca perturbación de la estructura celular. Además, al no alterar el interior de la célula, cualquier mecanismo intracelular que normalmente influya en el canal aún podrá funcionar como lo haría fisiológicamente. Usando este método también es relativamente fácil obtener la configuración correcta, y una vez obtenida es bastante estable.
Para los canales iónicos activados por ligandos o canales modulados por receptores metabotrópicos, el neurotransmisor o fármaco en estudio generalmente se incluye en la solución de pipeta, donde puede interactuar con lo que solía ser la superficie externa de la membrana. La actividad del canal resultante se puede atribuir al medicamento que se está utilizando, aunque generalmente no es posible cambiar la concentración del medicamento dentro de la pipeta. Por lo tanto, la técnica se limita a un punto en una curva de respuesta a la dosis por parche. Por lo tanto, la respuesta a la dosis se logra utilizando varias células y parches. Sin embargo, los canales iónicos dependientes de voltaje se pueden sujetar sucesivamente a diferentes potenciales de membrana en un solo parche. Esto resulta en la activación del canal en función de la tensión, y una curva I-V (corriente-tensión) completa se puede establecer en un solo parche. Otro inconveniente potencial de esta técnica es que, al igual que las vías intracelulares de la célula no se alteran, tampoco se pueden modificar directamente.
Parche de adentro hacia afuera
En el método de adentro hacia afuera, un parche de la membrana se une a la pipeta de parche, se separa del resto de la célula y la superficie citosólica de la membrana se expone al medio externo, o baño. Una ventaja de este método es que el experimentador tiene acceso a la superficie intracelular de la membrana a través del baño y puede cambiar la composición química de la superficie a la que está expuesta la membrana. Esto es útil cuando un experimentador desea manipular el ambiente en la superficie intracelular de canales iónicos individuales. Por ejemplo, los canales que son activados por ligandos intracelulares se pueden estudiar a través de un rango de concentraciones de ligandos.
Para lograr la configuración de adentro hacia afuera, la pipeta se une a la membrana celular como en el modo de conexión celular, formando un gigaseal, y luego se retrae para romper un parche de membrana del resto de la célula. La extracción de un parche de membrana a menudo resulta inicialmente en la formación de una vesícula de membrana en la punta de la pipeta, porque los extremos de la membrana del parche se fusionan rápidamente después de la escisión. La cara exterior de la vesícula debe abrirse para entrar en modo de adentro hacia afuera; esto se puede hacer tomando brevemente la membrana a través de la interfaz solución de baño/aire, exponiéndose a una solución de bajo contenido de Ca2+, o haciendo contacto momentáneo con una gotita de parafina o un trozo de polímero de silicona curado.
Registro de células enteras o parche de células totaleseditar
Las grabaciones de células completas implican el registro de corrientes a través de múltiples canales simultáneamente, en una gran región de la membrana celular. El electrodo se deja en su lugar en la célula, como en los registros conectados a la célula, pero se aplica más succión para romper el parche de membrana, proporcionando así acceso desde el interior de la pipeta al espacio intracelular de la célula. Esto proporciona un medio para administrar y estudiar cómo los tratamientos (por ejemplo, los medicamentos) pueden afectar a las células en tiempo real. Una vez que la pipeta está unida a la membrana celular, hay dos métodos para romper el parche. La primera es aplicando más succión. La cantidad y duración de esta succión depende del tipo de célula y del tamaño de la pipeta. El otro método requiere que se envíe un gran pulso de corriente a través de la pipeta. Cuánto se aplica corriente y la duración del pulso también dependen del tipo de célula. Para algunos tipos de células, es conveniente aplicar ambos métodos simultáneamente para romper el parche.
La ventaja de la grabación de pinza de parche de celda completa sobre la grabación de la técnica de electrodo afilado es que la abertura más grande en la punta del electrodo de pinza de parche proporciona una menor resistencia y, por lo tanto, un mejor acceso eléctrico al interior de la celda. Una desventaja de esta técnica es que debido a que el volumen del electrodo es mayor que el volumen de la célula, el contenido soluble del interior de la célula será reemplazado lentamente por el contenido del electrodo. Esto se conoce como el electrodo que «dializa» el contenido de la célula. Después de un tiempo, cualquier propiedad de la célula que dependa del contenido intracelular soluble se alterará. La solución de pipeta utilizada generalmente se aproxima al ambiente con alto contenido de potasio del interior de la célula para minimizar cualquier cambio que esto pueda causar. A menudo hay un período al comienzo de un registro de células completas en el que se pueden tomar mediciones antes de que la célula haya sido dializada.
Parche exterior y exterioreditar
El nombre «outside-out» enfatiza tanto la complementariedad de esta técnica con la técnica inside-out, como el hecho de que coloca la superficie externa en lugar de intracelular de la membrana celular en la parte exterior del parche de membrana, en relación con el electrodo de parche.
La formación de un parche de afuera hacia afuera comienza con una configuración de grabación de células enteras. Después de que se forma la configuración de la célula completa, el electrodo se retira lentamente de la célula, permitiendo que un bulbo de membrana salga de la célula. Cuando el electrodo se tira lo suficientemente lejos, esta burbuja se separará de la célula y se reformará como una membrana convexa en el extremo del electrodo (como una bola abierta en la punta del electrodo), con el exterior original de la membrana mirando hacia afuera del electrodo. Como muestra la imagen de la derecha, esto significa que el líquido dentro de la pipeta simulará el líquido intracelular, mientras que un investigador es libre de mover la pipeta y la burbuja con sus canales a otro baño de solución. Mientras que pueden existir múltiples canales en una burbuja de membrana, las grabaciones de un solo canal también son posibles en esta conformación si la burbuja de la membrana separada es pequeña y solo contiene un canal.
El parche exterior-exterior le da al experimentador la oportunidad de examinar las propiedades de un canal iónico cuando se aísla de la célula y se expone sucesivamente a diferentes soluciones en la superficie extracelular de la membrana. El experimentador puede perfundir el mismo parche con una variedad de soluciones en un período de tiempo relativamente corto, y si el canal es activado por un neurotransmisor o fármaco de la cara extracelular, se puede obtener una curva dosis-respuesta. Esta capacidad de medir la corriente a través de exactamente la misma pieza de membrana en diferentes soluciones es la ventaja distintiva del parche de afuera hacia afuera en relación con el método de conexión celular. Por otro lado, es más difícil de lograr. El proceso de formación más largo implica más pasos que podrían fallar y da como resultado una menor frecuencia de parches utilizables.
Parche perforadoeditar
Esta variación del método de pinza de parche es muy similar a la configuración de célula completa. La principal diferencia radica en el hecho de que cuando el experimentador forma el sello de gigaohmo, la succión no se utiliza para romper la membrana del parche. En cambio, la solución de electrodo contiene pequeñas cantidades de un agente antimicótico o antibiótico, como anfotericina-B, nistatina o gramicidina, que se difunde en el parche de membrana y forma pequeños poros en la membrana, proporcionando acceso eléctrico al interior de la célula. Cuando se comparan los métodos de parche perforado y de célula completa, se puede pensar en el parche de célula completa como una puerta abierta, en la que hay un intercambio completo entre las moléculas de la solución de pipeta y el citoplasma. El parche perforado se puede comparar con una puerta de malla que solo permite el intercambio de ciertas moléculas de la solución de pipeta al citoplasma de la célula.
Las ventajas del método de parche perforado, en relación con los registros de células enteras, incluyen las propiedades de los poros antibióticos, que permiten el equilibrio solo de pequeños iones monovalentes entre la pipeta del parche y el citosol, pero no de moléculas más grandes que no pueden penetrar a través de los poros. Esta propiedad mantiene niveles endógenos de iones divalentes como Ca2+ y moléculas de señalización como cAMP. En consecuencia, uno puede tener registros de toda la célula, como en el pinzamiento de parches de células enteras, mientras conserva la mayoría de los mecanismos de señalización intracelular, como en los registros conectados a las células. Como resultado, se reduce el recorrido de corriente y las grabaciones de parches perforados estables pueden durar más de una hora. Las desventajas incluyen una mayor resistencia de acceso, en relación con la célula completa, debido a que la membrana parcial ocupa la punta del electrodo. Esto puede disminuir la resolución actual y aumentar el ruido de grabación. También puede tomar una cantidad significativa de tiempo para que el antibiótico perfore la membrana (aproximadamente 15 minutos para la anfotericina-B, e incluso más tiempo para la gramicidina y la nistatina). La membrana debajo de la punta del electrodo se debilita por las perforaciones formadas por el antibiótico y puede romperse. Si el parche se rompe, la grabación se realiza en modo de célula completa, con antibióticos contaminando el interior de la célula.
Parche sueltoeditar
La abrazadera de parche suelto es diferente de las otras técnicas discutidas aquí en que emplea un sello suelto (baja resistencia eléctrica) en lugar del gigaseal apretado utilizado en la técnica convencional. Esta técnica se utilizó ya en el año 1961, como se describe en un artículo de Strickholm sobre la impedancia de la superficie de una célula muscular, pero recibió poca atención hasta que fue criada de nuevo y recibió un nombre por Almers, Stanfield y Stühmer en 1982, después de que la pinza de parche se estableciera como una herramienta importante de electrofisiología.
Para lograr una pinza de parche suelta en una membrana celular, la pipeta se mueve lentamente hacia la célula, hasta que la resistencia eléctrica del contacto entre la célula y la pipeta aumenta a unas cuantas veces más resistencia que la del electrodo solo. Cuanto más cerca esté la pipeta de la membrana, mayor será la resistencia de la punta de la pipeta, pero si se forma un sello demasiado cerca, y podría ser difícil retirar la pipeta sin dañar la célula. Para la técnica de parche suelto, la pipeta no se acerca lo suficiente a la membrana como para formar una conexión gigaseal o permanente, ni para perforar la membrana celular. La membrana celular permanece intacta, y la falta de un sello hermético crea un pequeño espacio a través del cual los iones pueden pasar fuera de la célula sin entrar en la pipeta.
Una ventaja significativa del sello suelto es que la pipeta utilizada se puede retirar repetidamente de la membrana después del registro, y la membrana permanecerá intacta. Esto permite mediciones repetidas en una variedad de ubicaciones en la misma celda sin destruir la integridad de la membrana. Esta flexibilidad ha sido especialmente útil para los investigadores para estudiar las células musculares, ya que se contraen en condiciones fisiológicas reales, obteniendo registros rápidamente y haciéndolo sin recurrir a medidas drásticas para evitar que las fibras musculares se contraigan. Una desventaja importante es que la resistencia entre la pipeta y la membrana se reduce en gran medida, lo que permite que la corriente se escape a través del sello y reduce significativamente la resolución de las corrientes pequeñas. Sin embargo, esta fuga se puede corregir parcialmente, lo que ofrece la oportunidad de comparar y contrastar grabaciones realizadas desde diferentes áreas de la celda de interés. Dado esto, se ha estimado que la técnica de parche suelto puede resolver corrientes menores de 1 mA/cm2.