Je nachdem, was der Forscher untersuchen möchte,können verschiedene Variationen der Grundtechnik angewendet werden. Die Inside-Out- und Outside-Out-Techniken werden als „exzidierte Patch“ -Techniken bezeichnet, da das Patch aus dem Hauptkörper der Zelle herausgeschnitten (entfernt) wird. Zellgebundene und beide exzidierte Patch-Techniken werden verwendet, um das Verhalten einzelner Ionenkanäle in dem an der Elektrode angebrachten Membranabschnitt zu untersuchen.
Whole-Cell-Patch und perforiertes Patch ermöglichen es dem Forscher, das elektrische Verhalten der gesamten Zelle anstelle von Einkanalströmen zu untersuchen. Das Whole-Cell-Patch, das einen niederohmigen elektrischen Zugang zum Inneren einer Zelle ermöglicht, hat jetzt weitgehend hochohmige Mikroelektrodenaufzeichnungstechniken ersetzt, um Ströme über die gesamte Zellmembran aufzuzeichnen.
Cell-attached Patchbearbeiten
Für dieses Verfahren wird die Pipette auf die Zellmembran versiegelt, um ein Gigaseal zu erhalten, während sichergestellt wird, dass die Zellmembran intakt bleibt. Dies ermöglicht die Aufzeichnung von Strömen durch einzelne oder wenige Ionenkanäle, die in dem von der Pipette aufgenommenen Membranfleck enthalten sind. Durch die bloße Anlagerung an die Außenseite der Zellmembran kommt es zu einer sehr geringen Störung der Zellstruktur. Indem das Innere der Zelle nicht gestört wird, können alle intrazellulären Mechanismen, die normalerweise den Kanal beeinflussen, weiterhin wie physiologisch funktionieren. Mit dieser Methode ist es auch relativ einfach, die richtige Konfiguration zu erhalten, und sobald sie erhalten ist, ist sie ziemlich stabil.
Bei ligandengesteuerten Ionenkanälen oder Kanälen, die durch metabotrope Rezeptoren moduliert werden, ist der zu untersuchende Neurotransmitter oder Wirkstoff normalerweise in der Pipettenlösung enthalten, wo er mit der ehemaligen äußeren Oberfläche der Membran interagieren kann. Die resultierende Kanalaktivität kann dem verwendeten Arzneimittel zugeschrieben werden, obwohl es normalerweise nicht möglich ist, die Arzneimittelkonzentration innerhalb der Pipette zu ändern. Die Technik ist somit auf einen Punkt in einer Dosis-Wirkungs-Kurve pro Pflaster beschränkt. Daher wird die Dosisreaktion unter Verwendung mehrerer Zellen und Pflaster erreicht. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle können jedoch nacheinander an verschiedenen Membranpotentialen in einem einzigen Patch geklemmt werden. Dies führt zu einer Kanalaktivierung als Funktion der Spannung, und eine vollständige I-V-Kurve (Strom-Spannung) kann in nur einem Patch erstellt werden. Ein weiterer potenzieller Nachteil dieser Technik besteht darin, dass die intrazellulären Signalwege der Zelle nicht gestört werden und auch nicht direkt modifiziert werden können.
Inside-Out-Patchbearbeiten
Bei der Inside-Out-Methode wird ein Patch der Membran an der Patchpipette befestigt, der vom Rest der Zelle abgelöst wird, und die cytosolische Oberfläche der Membran wird den externen Medien oder dem Bad ausgesetzt. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass der Experimentator über das Bad Zugang zur intrazellulären Oberfläche der Membran hat und die chemische Zusammensetzung dessen, was die Oberfläche der Membran ausgesetzt ist, verändern kann. Dies ist nützlich, wenn ein Experimentator die Umgebung an der intrazellulären Oberfläche einzelner Ionenkanäle manipulieren möchte. Zum Beispiel können Kanäle, die durch intrazelluläre Liganden aktiviert werden, dann durch eine Reihe von Ligandenkonzentrationen untersucht werden.
Um die Inside-Out-Konfiguration zu erreichen, wird die Pipette wie im Cell-Attached-Modus unter Bildung eines Gigaseals an der Zellmembran befestigt und dann zurückgezogen, um ein Membranstück vom Rest der Zelle abzubrechen. Das Abziehen eines Membranpflasters führt häufig zunächst zur Bildung eines Membranvesikels in der Pipettenspitze, da die Enden der Patchmembran nach der Exzision schnell miteinander verschmelzen. Die Außenseite des Vesikels muss dann aufgebrochen werden, um in den Inside-Out-Modus zu gelangen; dies kann geschehen, indem die Membran kurzzeitig durch die Grenzfläche zwischen Badlösung und Luft geführt wird, indem sie einer niedrigen Ca2 + -Lösung ausgesetzt wird oder indem sie kurzzeitig Kontakt mit einem Tropfen Paraffin oder einem Stück ausgehärtetem Silikonpolymer aufnimmt.
Whole-cell recording oder whole-cell Patchbearbeiten
Bei ganzzelligen Aufnahmen werden Ströme durch mehrere Kanäle gleichzeitig über einen großen Bereich der Zellmembran aufgezeichnet. Die Elektrode wird an Ort und Stelle auf der Zelle belassen, wie bei zellgebundenen Aufnahmen, aber es wird mehr Saugkraft angewendet, um das Membranpflaster zu zerreißen, wodurch der Zugang vom Inneren der Pipette zum intrazellulären Raum der Zelle ermöglicht wird. Dies bietet die Möglichkeit, in Echtzeit zu verabreichen und zu untersuchen, wie Behandlungen (z. B. Medikamente) Zellen beeinflussen können. Sobald die Pipette an der Zellmembran befestigt ist, gibt es zwei Methoden, um das Pflaster zu brechen. Die erste besteht darin, mehr Saugkraft anzuwenden. Die Menge und Dauer dieser Absaugung hängt von der Art der Zelle und der Größe der Pipette ab. Die andere Methode erfordert, dass ein großer Stromimpuls durch die Pipette gesendet wird. Wie viel Strom angelegt wird und wie lange der Impuls dauert, hängt auch vom Zelltyp ab. Für einige Zelltypen ist es zweckmäßig, beide Methoden gleichzeitig anzuwenden, um das Pflaster zu brechen.
Der Vorteil der Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung gegenüber der Scharfelektrodentechnik-Aufzeichnung besteht darin, dass die größere Öffnung an der Spitze der Patch-Clamp-Elektrode einen geringeren Widerstand und damit einen besseren elektrischen Zugang zum Zellinneren bietet. Ein Nachteil dieser Technik besteht darin, dass, weil das Volumen der Elektrode größer ist als das Volumen der Zelle, der lösliche Inhalt des Zellinneren langsam durch den Inhalt der Elektrode ersetzt wird. Dies wird als Elektrode bezeichnet, die den Inhalt der Zelle „dialysiert“. Nach einer Weile werden alle Eigenschaften der Zelle, die vom löslichen intrazellulären Inhalt abhängen, verändert. Die verwendete Pipettenlösung nähert sich normalerweise der kaliumreichen Umgebung des Zellinneren an, um etwaige dadurch verursachte Änderungen zu minimieren. Es gibt oft einen Zeitraum zu Beginn einer Ganzzellenaufzeichnung, in dem man Messungen durchführen kann, bevor die Zelle dialysiert wurde.
Außen-Außen-Patchbearbeiten
Der Name „Outside-Out“ betont sowohl die Komplementarität dieser Technik zur Inside-Out-Technik als auch die Tatsache, dass sie die äußere und nicht die intrazelluläre Oberfläche der Zellmembran auf der Außenseite des Membranflecks in Bezug auf die Patch-Elektrode platziert.
Die Bildung eines Outside-Out-Patches beginnt mit einer Ganzzellenaufzeichnungskonfiguration. Nachdem die Ganzzellkonfiguration gebildet ist, wird die Elektrode langsam aus der Zelle zurückgezogen, so dass eine Membrankugel aus der Zelle ausbleichen kann. Wenn die Elektrode weit genug weggezogen wird, löst sich diese Blase von der Zelle und bildet eine konvexe Membran am Ende der Elektrode (wie eine Kugel, die an der Elektrodenspitze offen ist), wobei die ursprüngliche Außenseite der Membran von der Elektrode nach außen zeigt. Wie das Bild rechts zeigt, bedeutet dies, dass die Flüssigkeit in der Pipette die intrazelluläre Flüssigkeit simuliert, während ein Forscher die Pipette und das Bleb mit seinen Kanälen in ein anderes Lösungsbad bewegen kann. Während in einer Membranblende mehrere Kanäle existieren können, sind in dieser Konformation auch Einkanalaufnahmen möglich, wenn die Membranblende klein ist und nur einen Kanal enthält.
Outside-Out-Patching gibt dem Experimentator die Möglichkeit, die Eigenschaften eines Ionenkanals zu untersuchen, wenn er aus der Zelle isoliert und nacheinander verschiedenen Lösungen auf der extrazellulären Oberfläche der Membran ausgesetzt wird. Der Experimentator kann das gleiche Pflaster mit einer Vielzahl von Lösungen in relativ kurzer Zeit perfundieren, und wenn der Kanal durch einen Neurotransmitter oder ein Medikament aus dem extrazellulären Gesicht aktiviert wird, kann dann eine Dosis-Wirkungs-Kurve erhalten werden. Diese Fähigkeit, Strom durch genau das gleiche Stück Membran in verschiedenen Lösungen zu messen, ist der deutliche Vorteil des Outside-Out-Patches gegenüber der zellgebundenen Methode. Auf der anderen Seite ist es schwieriger zu erreichen. Der längere Bildungsprozess umfasst mehr Schritte, die fehlschlagen können, und führt zu einer geringeren Häufigkeit verwendbarer Patches.
Perforierter Patchbearbeiten
Diese Variante der Patch-Clamp-Methode ist der Ganzzellenkonfiguration sehr ähnlich. Der Hauptunterschied liegt in der Tatsache, dass, wenn der Experimentator die Gigaohm-Dichtung bildet, die Absaugung nicht zum Aufbrechen der Patch-Membran verwendet wird. Stattdessen enthält die Elektrodenlösung geringe Mengen eines antimykotischen oder antibiotischen Mittels, wie Amphothericin-B, Nystatin oder Gramicidin, das in das Membranpflaster diffundiert und kleine Poren in der Membran bildet, die einen elektrischen Zugang zum Zellinneren ermöglichen. Beim Vergleich der Ganzzell- und perforierten Patch-Methoden kann man sich das Ganzzell-Patch als offene Tür vorstellen, in der ein vollständiger Austausch zwischen Molekülen in der Pipettenlösung und dem Zytoplasma stattfindet. Das perforierte Pflaster kann mit einer Bildschirmtür verglichen werden, die nur den Austausch bestimmter Moleküle von der Pipettenlösung zum Zytoplasma der Zelle ermöglicht.
Vorteile der perforierten Patch-Methode gegenüber Ganzzell-Aufnahmen sind die Eigenschaften der antibiotischen Poren, die nur die Äquilibrierung von kleinen einwertigen Ionen zwischen der Patchpipette und dem Cytosol ermöglichen, nicht jedoch von größeren Molekülen, die nicht durch die Poren durchdringen können. Diese Eigenschaft hält den endogenen Gehalt an zweiwertigen Ionen wie Ca aufrecht 2 + und Signalmoleküle wie cAMP. Folglich kann man Aufnahmen der gesamten Zelle haben, wie beim Whole-Cell-Patch-Clamping, unter Beibehaltung der meisten intrazellulären Signalmechanismen, wie bei zellgebundenen Aufnahmen. Infolgedessen wird der aktuelle Rundown reduziert, und stabile perforierte Patch-Aufnahmen können länger als eine Stunde dauern. Nachteilig ist ein höherer Zugangswiderstand, relativ zur Ganzzelle, aufgrund der die Spitze der Elektrode einnehmenden Teilmembran. Dies kann die aktuelle Auflösung verringern und das Aufzeichnungsrauschen erhöhen. Es kann auch eine beträchtliche Zeit dauern, bis das Antibiotikum die Membran perforiert hat (etwa 15 Minuten für Amphothericin-B und noch länger für Gramicidin und Nystatin). Die Membran unter der Elektrodenspitze wird durch die durch das Antibiotikum gebildeten Perforationen geschwächt und kann reißen. Wenn das Pflaster reißt, befindet sich die Aufnahme im Ganzzellmodus, wobei Antibiotika das Innere der Zelle kontaminieren.
Loser Patchbearbeiten
Die lose Patchklemme unterscheidet sich von den anderen hier diskutierten Techniken dadurch, dass sie eine lose Dichtung (niedriger elektrischer Widerstand) anstelle der bei der herkömmlichen Technik verwendeten dichten Gigaseal verwendet. Diese Technik wurde bereits im Jahr 1961 verwendet, wie in einem Artikel von Strickholm über die Impedanz der Oberfläche einer Muskelzelle beschrieben, erhielt jedoch wenig Aufmerksamkeit, bis sie 1982 von Almers, Stanfield und Stühmer erneut angesprochen und benannt wurde Patch Clamp war als wichtiges Instrument der Elektrophysiologie etabliert worden.
Um eine lose Patchklemme auf einer Zellmembran zu erreichen, wird die Pipette langsam in Richtung Zelle bewegt, bis der elektrische Widerstand des Kontakts zwischen der Zelle und der Pipette auf ein paar Mal größeren Widerstand ansteigt als der der Elektrode allein. Je näher die Pipette an die Membran gelangt, desto größer wird der Widerstand der Pipettenspitze, aber wenn zu nahe eine Dichtung gebildet wird, und es könnte schwierig werden, die Pipette zu entfernen, ohne die Zelle zu beschädigen. Bei der Loose-Patch-Technik kommt die Pipette nicht nahe genug an die Membran heran, um ein Gigaseal oder eine dauerhafte Verbindung zu bilden oder die Zellmembran zu durchstechen. Die Zellmembran bleibt intakt, und das Fehlen einer dichten Abdichtung erzeugt einen kleinen Spalt, durch den Ionen außerhalb der Zelle gelangen können, ohne in die Pipette einzutreten.
Ein wesentlicher Vorteil der losen Dichtung besteht darin, dass die verwendete Pipette nach der Aufnahme wiederholt von der Membran entfernt werden kann und die Membran intakt bleibt. Dies ermöglicht wiederholte Messungen an verschiedenen Stellen derselben Zelle, ohne die Integrität der Membran zu zerstören. Diese Flexibilität war für Forscher besonders nützlich, um Muskelzellen zu untersuchen, die sich unter realen physiologischen Bedingungen zusammenziehen, um schnell Aufzeichnungen zu erhalten, ohne auf drastische Maßnahmen zurückgreifen zu müssen, um die Kontraktion der Muskelfasern zu stoppen. Ein wesentlicher Nachteil besteht darin, dass der Widerstand zwischen der Pipette und der Membran stark verringert ist, wodurch Strom durch die Dichtung austreten kann und die Auflösung kleiner Ströme erheblich verringert wird. Diese Leckage kann jedoch teilweise korrigiert werden, was die Möglichkeit bietet, Aufnahmen aus verschiedenen Bereichen der interessierenden Zelle zu vergleichen und zu kontrastieren. Angesichts dessen wurde geschätzt, dass die Loose-Patch-Technik Ströme kleiner als 1 mA / cm2 auflösen kann.