ZKUŠEBNÍ METODY PRO FOTOTOXICITY A ZVÍŘE ALTERNATIVY
To je nezbytné k zajištění photosafety chemických látek, když tam jsou šance na expozici u člověka, což může být jasně dokládá léčiv (20) nebo kosmetiky (21). Pro vyhodnocení potenciálu fototoxicity chemické látky byly zavedeny různé zkušební metody od In silico(22), in chemico(23), in vitro po in vivo test. V chemicko testy jako ROS generace (24), zkoušky in vitro, které zahrnují 3T3 NRU test a 3D epidermis model, a in vivo studiích používajících morče, myš nebo pigmentovaných potkanů byly vyvinuty a běžně používanými (25).
světelný zdroj pro fototoxicitu. Světelný zdroj pro fototoxicita je velmi důležité, protože vlnových délkách, které zkoušená chemická látka absorbuje (absorpční spektrum) a dávka světelného záření (dosažitelná po přijatelnou dobu expozice) by měla být dostatečná k vyvolání fototoxicita (26). Solární simulátory, které simulují přirozené sluneční světlo, jsou považovány za ideální umělý zdroj světla (obr. 5).
distribuce ozařovacího výkonu filtrovaného solárního simulátoru by měla být blízká distribuci venkovního denního světla. Solární simulátory jsou vybaveny xenonovými oblouky nebo (dopovanými) rtuťovými halogenidovými oblouky. Rovněž by měly být vhodně filtrovány, aby se zmírnily vysoce cytotoxické vlnové délky UVB. Spektrum zaznamenané pod těmito filtry by se nemělo odchýlit od standardizovaného venkovního denního světla (specifikace: FDA CFR část 201.327, ISO 24444: 2010 (e), CIE-85-1989).
nicméně jiný světelný zdroj UVA, jako je UVA lampa, lze také použít se správným UV dozimetrem ke kontrole intenzity a vlnové délky. Intenzita světla (ozáření) se liší v závislosti na zdrojích a měla by být pravidelně kontrolována před každou zkouškou fototoxicity pomocí vhodného širokopásmového UV-metru. UV měřič musí být před každým měřením kalibrován. Doba ozařování tedy závisí na intenzitě světelného zdroje (např. pro 1,7 mW / cm2 světelného zdroje je pro dosažení 5 J/cm2 nutná 50 min expoziční doba). Doba ozařování se také liší v závislosti na zkušebních metodách. Dávkou 5 J/cm2 (měřeno v oblasti UVA) byla stanovena tak, aby být non-cytotoxické, ale dostatečně silný k vybuzení chemických látek vyvolat fototoxické reakce v 3T3 příjmu Neutrální červeně test.
3T3 neutrální červená absorpční test. Test 3T3 NRU byl oficiálně schválen OECD a schválen jako OECD TG432 13. dubna 2004 (3). Tento test hodnotí fotocytotoxicity prostřednictvím stanovení relativní snížení životaschopnosti buněk po expozici zkoušené článek v přítomnost versus absenci UV/VIS záření. Rozhodnutí o provedení zkoušky fototoxicity 3T3 NRU se provádí u chemických látek, které vykazují absorpční spektra v oblasti UV / VIS, pokud jsou rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle (17). To bylo navrhl, že pokud molární extinkce/absorpce koeficient je menší než 10 l × mol−1 × cm−1 chemické látky, je nepravděpodobné, že by fotoreaktivní (např. V UV kyvety s 1 cm dlouhé dráhy světla, OD 0,05 M roztoku musí být menší než 0,5 být považovány za non-fotoreaktivní na základě rovnice „absorbance = extinkční koeficient x délka cesty x koncentrace“) (26). Test 3T3 NRU vykazuje vysoce citlivou, ale nízkou specifickou prediktivní kapacitu (citlivost 93% a specificita 84%). 3T3 nru test má mnoho omezení. To nelze předvídat nepříznivé účinky jiné než na fotografii(cyto)toxicity, které mohou plynout z kombinovaného působení chemické látky a světla, jako jsou fotogenotoxicitu, fotoalergie(fotosenzitivita) nebo fotokarcinogenitu. Test 3T3 NRU se používá pouze pro identifikaci nebezpečí, zatímco jeho užitečnost pro posouzení fototoxické účinnosti není oprávněná.Zejména tento testovací systém postrádá metabolickou aktivitu, která je kritická při manifestaci systémově exponovaných chemikálií. Proto se u systémově exponovaných chemických látek, které vyžadují metabolickou aktivaci, jako je monokrotalin, riddelliin a heliotrin (pyrrolizidinové alkaloidy) (28), doporučují studie na zvířatech in vivo (5,29).
Základní princip testu z 3T3 NRU je srovnání životaschopnosti buněk v přítomnosti nebo nepřítomnosti UV/Vis záření, jak je stanoveno s vitálního barviva neutrální červeně, který je slabý kationtové barvivo, které snadno proniká do buněčných membrán a hromadí intracelulárně v lysosomech životaschopných buněk. Základní buněčná linie je Balb / c 3T3 buňka, což je myší fibroblast vyvinutý z myších embryí G. T. Todarem v roce 1968. Označení 3T3 znamená „3denní přenos, inokulum 3 × 105 buněk“ v misce 20 cm2 a tato buňka je relativně stabilní, snadno dostupná a snadno ovladatelná (30). Dermální fibroblast je jednou z cílových buněk fototoxicity, která poskytuje solidní zdůvodnění pro využití 3T3 buněk.
pro rozhodnutí, zda je zkoušený výrobek fototoxický nebo není v testu 3T3 NRU, musí být získána koncentrační odezva za přítomnosti a bez ozáření. Vypočte se faktor podráždění fotografií (PIF) nebo střední fotografický efekt (MPE) (31). PIF je poměr IC50 (koncentrace, která snižuje životaschopnost buněk o 50%) neozářených oproti ozářeným, jak je znázorněno na obr. 7.
Když IC50 nelze získat, MPE je vypočtena následující rovnice
PIF < 2 nebo MPE < 0.1 předpovídá: „žádná fototoxicita“. PIF > 2 a < 5 nebo MPE > 0,1 a < 0.15 předpovídá: „pravděpodobně fototoxická“ a PIF > 5 nebo MPE > 0.15 předpovídá: „fototoxicita“ (Obr. 8).
test hemolýzy erytrocytů. Buněčné membrány jsou citlivé na fotochemicky generované ROS a radikály. Poškození erytrocytů vyvolané UVA a výsledná hemolýza (fotohemolýza) je kapitalizována k posouzení fototoxického potenciálu testovaných článků (32). Červené krvinky ovcí (SRB) jsou inkubovány chemickými látkami a ozařovány UVA při 20 J / cm2. Po ozařování, SRBCs byly inkubovány ve tmě po dobu 2 hod při pokojové teplotě a poté po dobu další 1 hod při 37℃, po které hemolýzy byly měřeny s Drabkin činidla a měření UV absorbance při 540 nm. Rozsah fototoxicity byl hodnocen uvolněním hemoglobinu ze SRBC, tj. fotohemolytické aktivityjako podle rovnice (33).
-
ADE: optická hustota exponovaného roztoku léčiva s erytrocyty
-
NL: optická hustota vystaveny roztoku léku bez erytrocyty
-
C: optické hustoty z 100% hemolytická kontrolu řešení
Phototoxicants, jako je ciprofloxacin, norfloxacin nebo enoxacinem výrazně zvýšit photohemolytic aktivity nad rámec 20% na 100 µg/mL. Citlivost, specificita a přesnost tohoto testu byly 67%, 73% a 73%, respektive 24 chemických látek (8 vůní, 5 UV absorbéry, 4 drogy, 4 antimikrobiálních látek a 3 barviv) ve srovnání s in vivo na morčatech test (34). Nízká citlivost může být problematická a její výkon je mnohem horší než u testu 3T3 NRU, což může vysvětlit snížené použití tohoto testu v poslední době.
in vitro 3D model lidské epidermis. K překonání omezení metod založených na buňkách in vitro se zkoumá 3D rekonstruovaný model epidermis pro aplikaci na testy fototoxicity (35,36). Princip zkoušky je v zásadě podobný testu 3T3 NRU, konkrétně posouzení rozdílu životaschopnosti tkáně mezi přítomností a nepřítomností ozařování UV / VIS. Lze použít podobný Predikční model využívající PIF a MPE (37). V 3D epidermis model, nicméně, ve vodě nerozpustné materiály mohou být testovány a určité míry metabolické kapacity je zachována v primárních keratinocytů v epidermis vrstvu, která může být použita na toxické látky vyžadující metabolickou aktivaci (38). Navíc, měření produkce cytokinů jako IL-1β (Interleukin-1β) (39), comet assay (40) a histologické vyšetření je možné, že může být považován za do další hodnocení photoallergenicity a photocarcinogenecity.
in vivo metody využívající morče, myši nebo pigmentované krysy. Laboratorní zvířata, jako jsou myši a morčata, se používají k simulaci reálného scénáře lidské fototoxicity. Zvířata jsou vystavena chemickým látkám lokálně nebo systémově a ozářena vhodnou dávkou UVA (obvykle 10 J / cm2 pro test na morčatech, 20 J / cm2 pro test na myších (41)). Skóre erytému a edému od 0 do 4 je shrnuto a maximální skóre během 72 hodin pozorování je zprůměrováno na zvíře, aby se vytvořil index podráždění. Index fototoxicity je získán rovnicí „index podráždění uva-irradiated-index podráždění neozářeného místa“ (42). Index fototoxicity nad 0,6 indikuje potenciál fototoxicity. Alternativně může být měřena tloušťka ucha k odhadu otoku při testech na myších. Tyto in vivo testy dobře odrážejí patofyziologických proces fototoxicita v lidské, ale oběti zvířat, náklady a čas potřebný k provedení testu představuje mnoho problémů, a to zejména v době, široký-rozšířil povědomí o dobrých životních podmínek zvířat a etiky. Testy fototoxicity na zvířatech, které nejsou založeny na zvířatech, získávají v těchto dnech popularitu k překonání těchto problémů (43).
v chemických metodách pro hodnocení fototoxicity. Byly zkoumány metody bezbuněčných zkumavek, zejména v chemice, aby se vyhodnotila fototoxicita. Informace o světlo, absorbance a fotostabilita test článku byla analyzována předvídat, fototoxicita (44). Využití generování reaktivních forem kyslíku během fotoexcitace a následné fotoreakce, fototoxický potenciál chemické látky lze hodnotit v chemico (12). Singletního kyslíku je detekován p-nitrosodimethylaniline (RNO) bělení zatímco Nitro Blue-Trifenyltetrazolium Test (NBT-formazanu reakce) je zaměstnán určit vodíku generace, jak je znázorněno níže (24),
-
Singletního kyslíku + imidazol
-
→ → oxiduje imidazolu
-
+ RNO
-
→ RNO bělení + produkty
ROS generace testu vykazovaly citlivost a specifičnost 90% a 76,9% pro kosmetiku a 100% a 75% pro non-kosmetické chemikálie. Aktivita rozbití řetězce DNA je dalším způsobem, jak vyhodnotit UV indukovanou fototoxicitu různých druhů chemikálií nebo léčiv v chemice kvantifikací otevřené nebo uzavřené kruhové DNA. Tento test také nevyžaduje živé buňky nebo tkáně, ale plazmid. Plazmid se rozpustí v pufru a smísí se s testovanými předměty. Po ozáření směsi UV se vzorky podrobí elektroforéze. Množství rozbité DNA je analyzováno pomocí fluorescenční technologie. UV indukovaná fototoxická sloučenina vede k otevření řetězců DNA a je závislá na koncentraci léčiva a dávce UV záření (33). Tyto testy nevyžadují živé buňky nebo tkáně, které mohou zvýšit variabilitu výsledků testů. Nicméně, tyto metody mají svá omezení, které zahrnují nedostatek metabolické aktivace kapacity, nepoužitelnost vodě nerozpustné materiály (oleje, pevných látek, gely, upravených výrobků), a neschopnost předvídat fotogenotoxicitu, fotoalergie(fotosenzitivita) nebo fotokarcinogenitu. Tento test je omezen na identifikaci nebezpečí, nikoli na hodnocení fototoxické účinnosti.