TESTMETODER FOR FOTOTOKSISITET og DYR ALTERNATIVER
det er viktig å sikre fotosikkerhet av kjemikalier når det er sjanser for menneskelig eksponering som tydelig kan eksemplifiseres av legemidler (20) eller kosmetikk (21). For å evaluere potensialet for fototoksisitet av et kjemikalie, er det innført ulike testmetoder som spenner fra i silico(22), i chemico(23), in vitro til in vivo-analyse. I chemico-analyser som ROS-generasjon (24) er in vitro-test som inkluderer 3T3 NRU-analyse og 3d-epidermis-modell, og in vivo-studier med marsvin, mus eller pigmenterte rotter blitt utviklet og rutinemessig brukt (25).
Lyskilde for fototoksisitet. Lyskilde for fototoksisitet er ekstremt viktig siden bølgelengder absorbert av testkjemikaliet (absorpsjonsspektrum) og lysdosen (oppnåelig i rimelig eksponeringstid) bør være tilstrekkelig til å indusere fototoksisitet (26). Solar simulatorer som simulerer naturlig sollys regnes som den ideelle kunstige lyskilden(Fig. 5).
bestrålingseffektfordelingen til den filtrerte solsimulatoren bør være nær den for utendørs dagslys. Solar simulatorer er utstyrt med xenonbuer eller (dopet) kvikksølvmetallhalogenidbuer. De bør også være passende filtrert for å dempe de svært cytotoksiske UVB bølgelengder. Spekteret registrert under disse filtrene bør ikke avvike fra standardisert utendørs dagslys (Spesifikasjon: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444: 2010(e), CIE-85-1989).
likevel kan andre UVA-lyskilder som UVA-lampe også brukes med et riktig UV-dosimeter for å kontrollere intensiteten og bølgelengden. Lysintensiteten (irradiansen) varierer avhengig av kildene, og det bør kontrolleres regelmessig før hver fototoksisitetstest ved hjelp av en egnet bredbånds UV-meter. UV-måleren må være kalibrert før hver måling. Følgelig avhenger bestrålingstiden av intensiteten til lyskilden (for eksempel for 1,7 mW/cm2 lyskilde, er 50 min eksponeringstid nødvendig for å oppnå 5 j/cm2). Bestrålingstiden varierer også avhengig av testmetodene. En dose på 5 j / cm2 (målt I UVA-området) ble fastslått å være ikke-cytotoksisk, men tilstrekkelig potent til å eksitere kjemikalier for å fremkalle fototoksiske reaksjoner i 3t3 Nøytral rød opptaksanalyse.
3t3 Nøytral rød opptak analyse. 3T3 NRU-analysen er offisielt godkjent AV OECD og godkjent SOM OECD TG432 13. April 2004 (3). Denne testen evaluerer fotocytotoksisitet ved å bestemme den relative reduksjonen i cellens levedyktighet etter eksponering for testartikkelen i nærvær versus fravær AV UV / VIS-bestråling. Beslutning om å gjennomføre 3T3 NRU fototoksisitetstest blir tatt for kjemikaliene som viser absorpsjonsspektra I UV / VIS-regionen når de oppløses i passende løsningsmiddel (17). Det har blitt foreslått at hvis molar utryddelse / absorpsjonskoeffisient er mindre enn 10 liter x mol−1 x cm-1, er kjemikaliet usannsynlig å være fotoreaktivt (For EKSEMPEL I UV-kyvette med 1 cm lang lysbane, SKAL OD på 0,05 m oppløsning være mindre enn 0,5 for å bli vurdert som ikke-fotoreaktiv basert på ligningen «absorbans = utryddelseskoeffisient x banelengde x konsentrasjon») (26). 3T3 NRU test viser svært følsom, men lav spesifikk prediktiv kapasitet (en følsomhet på 93% og en spesifisitet på 84%). 3T3 NRU test har mange begrensninger. Det kan ikke forutsi andre bivirkninger enn foto (cyto)toksisitet som kan oppstå fra kombinert virkning av et kjemikalie og lys som fotogenotoksisitet, fotoallergi (fotosensibilisering) eller fotokarsinogenitet. 3T3 NRU-test brukes bare for fareidentifikasjon, mens dens nytte for vurdering av fototoksisk styrke ikke er berettiget.Spesielt mangler dette analysesystemet metabolsk aktivitet som er kritisk i manifestasjonen av systematisk eksponerte kjemikalier. Derfor, for systemisk eksponerte kjemikalier som krever metabolsk aktivering som monokrotalin, riddelliin og heliotrin (pyrrolizidinalkaloider) (28), anbefales in vivo dyreforsøk (5,29).
Grunnleggende testprinsipp FOR 3T3 NRU er sammenligningen av celleviabilitet i nærvær eller fravær AV UV/Vis-bestråling som bestemt med vitalt fargestoff, nøytral rød, som er et svakt kationisk fargestoff som lett trenger inn i cellemembraner og akkumulerer intracellulært i lysosomer av levedyktige celler. Basecellelinjen Er Balb / c 3t3 celle, som er mus fibroblast utviklet fra mus embryoer Av G. T. Todaro i 1968. 3t3 betegnelse står for «3-dagers overføring, inokulum 3 × 105 celler» i 20 cm2 tallerken, og denne cellen er relativt stabil, lett tilgjengelig og lett å håndtere (30). Dermal fibroblast er en av målcellene av fototoksisitet som gir en solid begrunnelse for ansettelse AV 3t3-celler.
for å avgjøre om testartikkelen er fototoksisk eller ikke I 3T3 NRU-analyse, skal konsentrasjonsresponsen oppnås i nærvær og i fravær av bestråling. Fotoirritasjonsfaktor (Pif) eller GJENNOMSNITTLIG Fotoeffekt (OED) skal beregnes (31). PIF er FORHOLDET MELLOM IC50 (konsentrasjon som reduserer cellens levedyktighet med 50%) av ikke-bestrålt over bestrålt som vist I Fig. 7.
NÅR IC50 ikke kan oppnås, BEREGNES OED som følgende ligning
PIF < 2 eller EN OED < 0.1 spår: «ingen fototoksisitet». En PIF > 2 og < 5 eller EN OED > 0,1 og < 0,15 forutsier: «sannsynlig fototoksisitet» og PIF > 5 eller EN OED > 0,15 forutsier: «fototoksisitet» (Fig. 8).
Erytrocyt hemolyse test. Cellemembraner er sårbare for fotokjemisk genererte ROS og radikaler. UVA-induserte skader på erytrocyt og resulterende hemolyse (fotohemolyse)er kapitalisert for å vurdere fototoksisk potensial av testartikler (32). Sau røde blodlegemer (SRBC) inkuberes med kjemikalier og bestråles MED UVA på 20 J/cm2. Etter bestråling ble SRBCs inkubert i mørket i 2 timer ved romtemperatur og deretter i ytterligere 1 time ved 37℃, hvoretter hemolyse ble målt Med Drabkins reagens og måling AV UV-absorbans ved 540 nm. Grad av fototoksisitet ble vurdert ved frigjøring av hemoglobin fra SRBC, dvs. fotohemolytisk aktivitetsom etter ligning (33).
-
ade: optisk tetthet av eksponert legemiddelløsning med erytrocytter
-
ANNONSE: optisk tetthet av eksponert legemiddeloppløsning uten erytrocytter
-
c: optisk tetthet av 100% hemolytisk kontrollløsning
Fototoksikanter som ciprofloksacin, norfloksacin eller enoksacin øker fotohemolytisk aktivitet betydelig utover 20% ved 100 µ / mL. Sensitiviteten, spesifisiteten og nøyaktigheten av denne testen var henholdsvis 67%, 73% og 73% for 24 kjemikalier (8 dufter, 5 UV-absorbenter, 4 legemidler, 4 antimikrobielle midler og 3 fargestoffer) sammenlignet med in vivo marsvin test (34). Lav følsomhet kan være problematisk, og ytelsen er mye dårligere ENN 3T3 NRU-test, noe som kan forklare den reduserte bruken av denne testen nylig.
in vitro human 3d epidermis modell. For å overvinne begrensningene i in vitro cellebaserte metoder, undersøkes 3D-rekonstruert epidermis-modell for anvendelse på fototoksisitetstester (35,36). I utgangspunktet er testprinsippet lik 3T3 NRU-test, nemlig vurderingen av forskjellen i vevs levedyktighet mellom i nærvær og fravær AV UV / VIS-bestråling. Tilsvarende prediksjonsmodell med PIF og OED kan benyttes (37). I 3d-epidermis-modellen kan imidlertid vannløselige materialer testes og en viss grad av metabolsk kapasitet bevares i de primære keratinocyttene i epidermallaget som kan påføres toksikanter som krever metabolsk aktivering (38). Videre er det mulig å måle cytokinproduksjon SOM IL-1Β (Interleukin-1β) (39), kometanalyse (40) og histologisk undersøkelse som kan vurderes i den videre evalueringen av fotoallergenitet og fotokarsinogenitet.
in vivo metoder som benytter marsvin, mus eller pigmenterte rotter. Laboratoriedyr som mus og marsvin blir ansatt for å simulere virkelige scenario av menneskelig fototoksisitet. Dyr utsettes for kjemikalier lokalt eller systemisk og bestråles med passende dose UVA (vanligvis 10 J/cm2 for marsvin test, 20 J/cm2 for mus test (41)). Scoring av erytem og ødem fra 0 til 4 er oppsummert og maksimal score i løpet av 72 timer med observasjon er gjennomsnittlig per dyr for å generere irritasjonsindeks. Fototoksisitetsindeks oppnås ved ligningen» Irritasjonsindeks FOR UVA-bestrålt – Irritasjonsindeks for ikke-bestrålt sted » (42). Fototoksisitetsindeks over 0,6 indikerer potensialet for fototoksisitet. Alternativt kan øretykkelse måles for å estimere ødem i musetester. Disse in vivo-testene gjenspeiler den patofysiologiske prosessen med fototoksisitet hos mennesker, men ofre av dyr, utgifter og tid som kreves for å utføre testen, utgjør mange problemer, spesielt i en tid med bred spredning av bevissthet om dyrevelferd og etikk. Ikke-dyrbaserte fototoksisitetstester blir stadig mer populært i disse dager for å overvinne disse problemene (43).
i chemico metoder for fototoksisitet evaluering. Cellefrie testrørmetoder, nemlig i chemico, har blitt utforsket for å vurdere fototoksisitet. Informasjon om lysabsorbans og fotostabilitet av testartikkelen er analysert for å forutsi fototoksisitet (44). Ved bruk av generering av reaktive oksygenarter under fotoeksitasjon og påfølgende fotoreaksjon, kan fototoksisk potensial for et kjemikalie evalueres i chemico(12). Singlet oksygen påvises ved p-nitrosodimetylanilin (rno) bleking mens Nitro Blå-Tetrazolium Test (NBT-formazan reaksjon) er ansatt for å bestemme peroksid generasjon som vist nedenfor (24),
-
Singlet oksygen + imidazol
-
→ → oksidert imidazol
-
+ RNO
-
→ rno bleking + produkter
ROS generasjonsanalyse viste sensitivitet og spesifisitet på 90% og 76,9% for kosmetikk og 100% og 75% for ikke-kosmetiske kjemikalier. DNA strand bryte aktivitet ER en annen måte å evaluere UV indusert fototoksisitet av ulike typer kjemikalier, eller narkotika i chemico gjennom kvantifisere åpen ELLER lukket sirkulær DNA. Denne analysen krever heller ikke levende celler eller vev, men plasmid. Plasmid oppløses i buffer og blandes med testartikler. Etter at blandingen er bestrålt MED UV, blir prøver utsatt for elektroforese. Mengden av brudd DNA er analysert av fluorescerende-basert teknologi. UV-indusert fototoksisk forbindelse resulterer i åpning AV DNA-tråder, og det er avhengig av legemiddelkonsentrasjon og UV-bestrålingsdose (33). Disse testene krever ikke levende celler eller vev som kan legge til variabiliteten av testresultatene. Imidlertid har disse metodene begrensninger som inkluderer mangel på metabolsk aktiveringskapasitet, uanvendelighet av vannløselige materialer(oljer, faste stoffer, geler, formulerte produkter) og manglende evne til å forutsi fotogenotoksisitet, fotoallergi (fotosensibilisering) eller fotokarsinogenitet. Denne testen er begrenset til fareidentifikasjon, ikke for vurdering av fototoksisk styrke.