PMC

VALOMYRKYLLISYYTTÄ ja ELÄINVAIHTOEHTOJA koskevat testimenetelmät

on olennaisen tärkeää varmistaa kemikaalien valoturvallisuus silloin, kun ihmisen altistuminen on mahdollista, kuten lääkkeet (20) tai kosmetiikka (21) voivat selvästi osoittaa. Kemikaalin valomyrkyllisyyden potentiaalin arvioimiseksi on otettu käyttöön erilaisia testimenetelmiä, jotka vaihtelevat in silico(22), in chemico(23), in vitro ja In vivo-määrityksistä. Chemico-määrityksissä, kuten ROS generation (24), on kehitetty ja rutiininomaisesti käytetty in vitro-testiä, johon sisältyy 3T3 NRU-määritys ja 3D orvaskesmalli, sekä in vivo-tutkimuksia marsuilla, hiirillä tai pigmentoiduilla rotilla (25).

valonlähde valomyrkylle. Valomyrkyllisyyden kannalta valonlähde on erittäin tärkeä, koska testikemikaalin absorboimien aallonpituuksien (absorptiospektri) ja valoannoksen (joka on saavutettavissa Kohtuullisessa altistusajassa) on oltava riittävä valomyrkyllisyyden indusoimiseksi (26). Aurinkosimulaattoreita, jotka simuloivat luonnollista auringonvaloa, pidetään ihanteellisena keinotekoisena valonlähteenä (Kuva. 5).

suodatetun aurinkosimulaattorin säteilytehon jakauman tulisi olla lähellä ulkovalon säteilytehon jakautumista. Aurinkosimulaattorit on varustettu ksenonkaarilla tai (seostetuilla) elohopeametallihalidikaarilla. Ne on myös suodatettava sopivasti voimakkaasti sytotoksisten UVB-aallonpituuksien vaimentamiseksi. Näiden suodattimien alle tallennetut spektrit eivät saa poiketa standardoidusta ulkovalosta (spesifikaatio: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444: 2010 (e), CIE-85-1989).

kuitenkin myös muuta UVA-valonlähdettä, kuten UVA-lamppua, voidaan käyttää asianmukaisella UV-dosimetrillä voimakkuuden ja aallonpituuden tarkistamiseen. Valon voimakkuus (säteilyvoimakkuus) vaihtelee lähteestä riippuen, ja se on tarkistettava säännöllisesti ennen jokaista valomyrkyllisyystestiä käyttäen sopivaa laajakaistaista UV-mittaria. UV-mittari on kalibroitava ennen jokaista mittausta. Näin ollen säteilytysaika riippuu valonlähteen voimakkuudesta (esimerkiksi 1,7 mW/cm2 valonlähteelle tarvitaan 50 minuutin valotusaika, jotta saavutetaan 5 J/cm2). Säteilytysaika vaihtelee myös testimenetelmien mukaan. Annos 5 J / cm2 (mitattuna UVA-alueella) todettiin ei-sytotoksiseksi, mutta riittävän voimakkaaksi herättämään kemikaaleja fototoksisten reaktioiden aikaansaamiseksi 3T3 Neutral red uptake-määrityksessä.

3T3 Neutral red uptake assay. 3T3 NRU-määritys on virallisesti hyväksytty OECD: ssä ja hyväksytty OECD: n TG432: ksi 13. huhtikuuta 2004 (3). Tässä testissä arvioidaan fotosytotoksisuutta määrittämällä solujen elinkyvyn suhteellinen aleneminen testiartikkelille altistumisen jälkeen UV/VIS-säteilytyksen puuttuessa. 3T3 NRU-valomyrkyllisyystesti päätetään tehdä kemikaaleille, joiden absorptiospektrit ovat UV/VIS-alueella, kun ne liuotetaan sopivaan liuottimeen (17). On ehdotettu, että jos moolinen ekstinktio/absorptiokerroin on alle 10 litraa X mol−1 x cm−1, kemikaali ei todennäköisesti ole fotoreaktiivinen (esim.UV-kalvossa, jossa on 1 cm pitkä valotie, 0,05 M: n liuoksen OD: n on oltava alle 0,5, jotta sitä voidaan pitää ei-fotoreaktiivisena yhtälön ”absorbanssi = ekstinktiokerroin x reitin pituus x pitoisuus” perusteella) (26). 3T3 NRU-testillä on erittäin herkkä, mutta heikko spesifinen ennustuskyky (herkkyys 93% ja spesifisyys 84%). 3T3 NRU-testillä on monia rajoituksia. Sillä ei voida ennustaa muita haittavaikutuksia kuin fototoksisuutta(syto), joka voi aiheutua kemikaalin ja valon yhteisvaikutuksesta, kuten fotogenotoksisuutta, fotoallergiaa(valoherkkyyttä) tai fotokarsinogeenisuutta. 3T3 NRU-testiä käytetään vain vaarojen tunnistamiseen, kun taas sen hyödyllisyys valotoksisen tehon arvioinnissa ei ole perusteltua.Erityisesti tästä määritysjärjestelmästä puuttuu metabolinen aktiivisuus, joka on kriittinen systeemisesti altistuvien kemikaalien ilmentymisessä. Siksi systeemisesti altistuville kemikaaleille, jotka vaativat metabolista aktivaatiota, kuten monokrotaliinille, riddelliinille ja heliotriinille (pyrrolitsidiinialkaloidit) (28), suositellaan in vivo-eläinkokeita (5,29).

3T3 NRU: n perusperiaate on solujen elinkyvyn vertailu UV/Vis-säteilytyksen läsnä ollessa tai ilman määritettynä elintärkeällä väriaineella neutraalipunalla, joka on heikko kationinen väriaine, joka tunkeutuu helposti solukalvoihin ja kerääntyy solunsisäisesti elinkykyisten solujen lysosomeihin. Emäsolulinja on Balb / c 3T3-solu, joka on hiiren fibroblasti, jonka kehitti hiiren alkioista G. T. Todaro vuonna 1968. 3T3-nimitys tulee sanoista ”3-päivän siirto, inokulaatti 3 × 105 solua” 20 cm2-astiassa, ja tämä solu on suhteellisen vakaa, helposti saatavilla ja helppo käsitellä (30). Ihon fibroblasti on yksi fototoksisuuden kohdesoluista, mikä antaa vankat perusteet 3T3-solujen työllistymiselle.

sen määrittämiseksi, onko testiaine fototoksinen 3T3 NRU-määrityksessä, pitoisuus-vaste on saatava säteilytyksen läsnä ollessa ja ilman sitä. Valoärsytystekijä (PIF) tai keskimääräinen Kuvavaikutus (MPE) on laskettava (31). PIF on IC50: n (pitoisuus, joka vähentää solujen elinkykyä 50%) suhde Säteilyttämättömään säteilytettyyn verrattuna, kuten kuvassa esitetään. 7.

Fotosytotoksisuuden ennustemalli PIF: llä (Valoärsytystekijä).

kun IC50: tä ei voida saada, MPE lasketaan seuraavalla yhtälöllä

PIF < 2 tai MPE < 0,1 ennustaa: ”ei valomyrkyllisyyttä”. PIF > 2 ja < 5 tai MPE > 0, 1 ja < 0, 15 ennustaa: ”todennäköinen valomyrkyllisyys” ja PIF > 5 tai MPE > 0, 15 ennustaa: ”valomyrkyllisyys” (Kuva. 8).

Kuvaefektin laskeminen: kuvaefekti (PEC) mielivaltaisella C-pitoisuudella määritellään vasteefektin (REC) ja annosefektin (DEC) tulona eli PEC = REC × DEC. Määritelmä on esitetty sellaisena kuin se on hyväksytty (31). Kuvaefektin laskeminen pitoisuudella 0,4 seuraa tekstissä annettuja yhtälöitä, jotka antavat: vasteefekti RE0.4 = (66% − 11%)/100% = 0.55, annosvaikutus DE0.4 = (0.4/0.16 − 1)/(0.4/0.16 + 1) = 0.43, ja valokuvaefekti PE0. 4 = 0,24. Keskimääräinen kuvaefekti saadaan laskemalla eri pitoisuuksilla (31) kuvaefektin arvojen keskiarvo.

punasolujen hemolyysitesti. Solukalvot ovat alttiita valokemiallisesti syntyville ROS: ille ja radikaaleille. UVA-indusoidut erytrosyyttien vauriot ja tuloksena oleva hemolyysi (fotohemolyysi)aktivoidaan testiartikkelien fototoksisen potentiaalin arvioimiseksi (32). Lampaan punasoluja (SRBC) inkuboidaan kemikaaleilla ja säteilytetään UVA: lla nopeudella 20 J/cm2. Säteilytyksen jälkeen Srbc-yhdisteitä inkuboitiin pimeässä 2 tunnin ajan huoneenlämmössä ja sitten vielä 1 tunnin ajan 37℃: ssa, minkä jälkeen hemolyysi mitattiin Drabkinin reagenssilla ja UV-absorbanssin mittaus 540 nm: ssä. Valomyrkyllisyyden laajuus arvioitiin hemoglobiinin vapautumisella SRBC: stä eli fotohemolyyttisellä aktiivisuudella yhtälön (33) jälkeen.

• ADE: altistetun lääkeliuoksen optinen tiheys punasoluilla

• AD: altistetun lääkeliuoksen optinen tiheys ilman punasoluja

• C: 100% hemolyyttisen kontrolliliuoksen optinen tiheys

Valotoksiset aineet, kuten siprofloksasiini, norfloksasiini tai enoksasiini lisäävät fotohemolyyttistä aktiivisuutta merkittävästi yli 20% annoksella 100 µg/mL. Tämän testin herkkyys, spesifisyys ja tarkkuus olivat 67%, 24 kemikaalille (8 hajustetta, 5 UV-absorboivaa ainetta, 4 lääkettä, 4 mikrobilääkettä ja 3 väriainetta) ja 73% verrattuna in vivo-marsutestiin (34). Alhainen herkkyys voi olla ongelmallista ja sen suorituskyky on paljon huonompi kuin 3T3 NRU-testissä, mikä voi selittää tämän testin vähentyneen käytön viime aikoina.

In vitro ihmisen 3D-orvaskeden malli. Solupohjaisten in vitro-menetelmien rajoitusten poistamiseksi tutkitaan 3D-rekonstruoitua orvaskesmallia sovellettavaksi valomyrkyllisyystesteihin (35,36). Periaatteessa testiperiaate on samanlainen kuin 3T3 NRU-testi, eli kudoksen elinkyvyn eron arviointi UV/VIS-säteilytyksen ja sen puuttuessa. Samanlaista ennustemallia, jossa käytetään PIF: ää ja MPE: tä, voidaan käyttää (37). 3D-orvaskesmallissa voidaan kuitenkin testata veteen liukenemattomia materiaaleja ja tietty metabolinen kapasiteetti säilyy primaarisissa keratinosyyteissä epidermaalisessa kerroksessa, jota voidaan levittää metabolista aktivaatiota vaativiin toksisiin aineisiin (38). Lisäksi sytokiinituotannon, kuten IL-1β: n (interleukiini-1β: n) (39), comet-määrityksen (40) ja histologisen tutkimuksen mittaaminen ovat mahdollisia, joita voidaan harkita valoallergisuuden ja fotokarsinogeenisuuden jatkotutkimuksissa.

in vivo-menetelmät, joissa käytetään marsua, hiirtä tai pigmentoituja rottia. Koe-eläimiä, kuten hiiriä ja marsuja, käytetään simuloimaan ihmisen valomyrkyllisyyttä. Eläimet altistetaan paikallisesti tai systeemisesti kemikaaleille ja säteilytetään asianmukaisella UVA-annoksella (marsukokeessa yleensä 10 J/cm2, hiirikokeessa 20 J/cm2 (41)). Eryteeman ja turvotuksen pisteytys 0: sta 4: ään lasketaan yhteen ja enimmäispistearvo 72 tunnin havainnoinnin aikana lasketaan keskimäärin eläintä kohti ärsytysindeksin tuottamiseksi. Valomyrkyllisyysindeksi saadaan yhtälöstä ”irritation index of UVA – irradiated-Irritation index of non-irradiated site” (42). Valomyrkyllisyysindeksi yli 0,6 osoittaa valomyrkyllisyyden potentiaalin. Vaihtoehtoisesti korvan paksuutta voidaan mitata turvotuksen arvioimiseksi hiirikokeissa. Nämä in vivo-testit kuvastavat hyvin ihmisen valomyrkyllisyyden patofysiologista prosessia, mutta eläinten uhraaminen, testin suorittamiseen tarvittavat Kulut ja aika aiheuttavat monia ongelmia erityisesti eläinten hyvinvointia ja etiikkaa koskevan laajan tietoisuuden aikakaudella. Muiden kuin eläinperäisten valomyrkyllisyystestien suosio kasvaa näinä päivinä näiden ongelmien ratkaisemiseksi (43).

In chemico methods for phototoxicity evaluation. Valomyrkyllisyyden arvioimiseksi on tutkittu soluttomia koeputkimenetelmiä eli chemicoa. Valomyrkyllisyyden ennustamiseksi on analysoitu tietoja testiaineen valon absorbanssista ja valotuskyvystä (44). Käyttämällä reaktiivisten happilajien tuottamista fotoekscitaation ja sitä seuraavan fotoreaktion aikana kemikaalin fototoksinen potentiaali voidaan arvioida chemicossa (12). Singlet happi havaitaan P-nitrosodimetyylianiliini (RNO) valkaisu kun Nitro Sininen Tetratsolium testi (NBT-formatsan reaktio) käytetään määrittämään peroksidin sukupolven alla kuvatulla tavalla (24),

• Singlet happi + imidatsoli

• → → hapetettu imidatsoli

• + RNO

• → RNO valkaisu + tuotteet

Ros generation-määrityksessä osoitettiin 90%: n ja 76,9%: n herkkyys ja spesifisyys kosmetiikassa ja 100%: n ja 75%: n herkkyys ja spesifisyys ei-kosmeettisissa kemikaaleissa. DNA juosteen breaking aktiivisuus on toinen tapa arvioida UV aiheuttama valomyrkyllisyys erilaisia kemikaaleja, tai huumeiden chemico kautta kvantifioimalla avoin tai suljettu pyöreä DNA. Tämä määritys ei myöskään vaadi eläviä soluja tai kudoksia, vaan plasmidia. Plasmidi liuotetaan puskuriin ja sekoitetaan testiartikkeleihin. Kun seos on säteilytetty UV-säteilyllä, näytteet altistetaan elektroforeesille. Rikkoutuneen DNA: n määrä analysoidaan fluoresoivalla tekniikalla. UV-indusoitu fototoksinen yhdiste saa aikaan DNA-juosteiden avaamisen ja se on riippuvainen lääkeainepitoisuudesta ja UV-säteilyannoksesta (33). Nämä testit eivät vaadi eläviä soluja tai kudoksia, jotka voivat lisätä testitulosten vaihtelua. Näillä menetelmillä on kuitenkin rajoituksia, joita ovat metabolisen aktivaatiokyvyn puute, veteen liukenemattomien materiaalien (öljyt, kiinteät aineet, geelit, formuloidut tuotteet) soveltumattomuus ja kyvyttömyys ennustaa fotogenotoksisuutta, fotoallergiaa(valoherkkyys) tai fotokarsinogeenisuutta. Tämä testi rajoittuu vaarojen tunnistamiseen, ei valomyrkyllisyyden arviointiin.