metode de testare pentru fototoxicitate și alternative la animale
este esențial să se asigure fotosecuritatea substanțelor chimice atunci când există șanse de expunere la om, astfel cum se poate exemplifica în mod clar în produsele farmaceutice (20) sau cosmetice (21). Pentru a evalua potențialul de fototoxicitate al unei substanțe chimice, au fost introduse diferite metode de testare care variază de la in silico(22), în chemico(23), in vitro până la in vivo. În testele chemico, cum ar fi generația ROS (24), au fost dezvoltate și utilizate în mod obișnuit teste in vitro care includ testul 3T3 NRU și modelul de epidermă 3D și studii in vivo care utilizează cobai, șoarece sau șobolani pigmentați (25).
sursă de lumină pentru fototoxicitate. Sursa de lumină pentru fototoxicitate este extrem de importantă, deoarece lungimile de undă absorbite de substanța chimică testată (spectrul de absorbție) și doza de lumină (realizabilă într-un timp de expunere rezonabil) ar trebui să fie suficiente pentru a induce fototoxicitatea (26). Simulatoarele solare care simulează lumina naturală a soarelui sunt considerate sursa ideală de lumină artificială (Fig. 5).
distribuția puterii de iradiere a simulatorului solar filtrat ar trebui să fie apropiată de cea a luminii de zi în aer liber. Simulatoarele solare sunt echipate cu arce xenon sau arce (dopate) cu halogenuri de mercur-metal. De asemenea, acestea ar trebui să fie filtrate corespunzător pentru a atenua lungimile de undă UVB foarte citotoxice. Spectrul înregistrat sub aceste filtre nu trebuie să se abată de la lumina naturală standardizată în aer liber (specificație: FDA CFR Partea 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
cu toate acestea, alte surse de lumină UVA, cum ar fi lampa UVA, pot fi utilizate și cu un dozimetru UV adecvat pentru a verifica intensitatea și lungimea de undă. Intensitatea luminii (iradianța) variază în funcție de surse și trebuie verificată în mod regulat înainte de fiecare test de fototoxicitate folosind un contor UV adecvat în bandă largă. Contorul UV trebuie să fi fost calibrat înainte de fiecare măsurare. În consecință, timpul de iradiere depinde de intensitatea sursei de lumină (de exemplu, pentru sursa de lumină de 1,7 mW/cm2, este necesar un timp de expunere de 50 min pentru a atinge 5 J/cm2). Timpul de iradiere variază, de asemenea, în funcție de metodele de testare. O doză de 5 J/cm2 (măsurată în intervalul UVA) a fost determinată a fi non-citotoxică, dar suficient de puternică pentru a excita substanțele chimice pentru a provoca reacții fototoxice în testul de absorbție roșu neutru 3T3.
test de absorbție roșu neutru 3T3. Testul 3T3 NRU a fost aprobat oficial de OCDE și aprobat ca OCDE TG432 în 13 aprilie 2004 (3). Acest test evaluează fotocitotoxicitatea prin determinarea reducerii relative a viabilității celulare după expunerea la articolul testat în prezența versus absența iradierii UV/VIS. Se ia decizia de a efectua testul de fototoxicitate 3T3 NRU pentru substanțele chimice care prezintă spectre de absorbție în regiunea UV / VIS atunci când sunt dizolvate în solvent adecvat (17). S−a sugerat că, în cazul în care coeficientul de extincție/absorbție molară este mai mic de 10 litri x mol−1 x cm-1, este puțin probabil ca substanța chimică să fie fotoreactivă (de exemplu, în cuva UV cu traiectorie luminoasă lungă de 1 cm, OD a soluției de 0,05 M trebuie să fie mai mică de 0,5 pentru a fi considerată non-fotoreactivă pe baza ecuației „absorbanță = coeficient de extincție x lungimea traiectoriei x concentrație”) (26). Testul 3T3 NRU prezintă o capacitate predictivă specifică extrem de sensibilă, dar scăzută (o sensibilitate de 93% și o specificitate de 84%). Testul 3T3 NRU are multe limitări. Nu poate prezice alte efecte adverse decât toxicitatea foto(Cito)care pot apărea din acțiunea combinată a unei substanțe chimice și a luminii, cum ar fi fotogenotoxicitatea, fotoalergia(fotosensibilizarea) sau fotocarcinogenitatea. Testul 3T3 NRU este utilizat numai pentru identificarea pericolelor, în timp ce utilitatea sa pentru evaluarea potenței fototoxice nu este justificată.În special, acest sistem de testare nu are activitate metabolică, care este critică în manifestarea substanțelor chimice expuse sistemic. Prin urmare, pentru substanțele chimice expuse sistemic care necesită activare metabolică, cum ar fi monocrotalina, riddelliina și heliotrina (alcaloizi pirolizidinici) (28), se recomandă studii in vivo la animale (5,29).
principiul fundamental al testului 3T3 NRU este compararea viabilității celulare în prezența sau absența iradierii UV/Vis determinată cu colorant vital, roșu neutru, care este un colorant cationic slab care pătrunde ușor în membranele celulare și se acumulează intracelular în lizozomii celulelor viabile. Linia celulară de bază este celula Balb/c 3T3, care este fibroblast de șoarece dezvoltat din embrioni de șoarece de G. T. Todaro în 1968. Denumirea 3T3 înseamnă ” transfer de 3 zile, inocul 3 celule 105 de la 20 cm2, iar această celulă este relativ stabilă, ușor disponibilă și ușor de manevrat (30). Fibroblastul dermic este una dintre celulele țintă de fototoxicitate care oferă o justificare solidă pentru angajarea celulelor 3T3.
pentru a decide dacă articolul testat este fototoxic sau nu în testul 3T3 NRU, concentrația-răspuns se obține în prezența și în absența iradierii. Se calculează factorul de fotoiritație (PIF) sau efectul mediu de fotoiritație (EIP) (31). PIF este raportul dintre IC50 (concentrație care scade viabilitatea celulară cu 50%) de neiradiat peste iradiat așa cum se arată în Fig. 7.
când IC50 nu poate fi obținut, eroarea maximă admisă se calculează după cum urmează ecuația
PIF < 2 sau un MPE < 0.1 prezice: „fără fototoxicitate”. Un PIF > 2 și < 5 sau un MPE > 0,1 și < 0,15 prezice: „fototoxicitate probabilă” și PIF > 5 sau un MPE > 0,15 prezice: „fototoxicitate” (Fig. 8).
testul hemolizei eritrocitare. Membranele celulare sunt vulnerabile la ROS și radicali generați fotochimic. Daunele induse de UVA ale eritrocitelor și hemoliza rezultată (fotohemoliza)sunt valorificate pentru a evalua potențialul fototoxic al articolelor de testare (32). Celulele roșii din sânge de oaie (SRBC) sunt incubate cu substanțe chimice și iradiate cu UVA la 20 J/cm2. În urma iradierii, SRBC – urile au fost incubate în întuneric timp de 2 ore la temperatura camerei și apoi încă 1 oră la 37 de ore, după care hemoliza a fost măsurată cu reactivul lui Drabkin și măsurarea absorbanței UV la 540 nm. Gradul de fototoxicitate a fost evaluat prin eliberarea hemoglobinei din SRBC, adică activitatea fotohemolitică ca urmare a ecuației (33).
-
ADE: densitatea optică a soluției de medicament expuse cu eritrocite
-
AD: densitatea optică a soluției de medicament expuse fără eritrocite
-
C: densitatea optică a soluției de control hemolitic 100%
Fototoxicanții precum ciprofloxacina, norfloxacina sau enoxacina cresc semnificativ activitatea fotohemolitică dincolo de 20% la 100 octoxacin/mL. Sensibilitatea, specificitatea și precizia acestui test au fost de 67%, 73% și, respectiv, 73% pentru 24 de substanțe chimice (8 parfumuri, 5 absorbanți UV, 4 medicamente, 4 antimicrobiene și 3 coloranți) comparativ cu testul in vivo de cobai (34). Sensibilitatea scăzută poate fi problematică, iar performanța sa este mult inferioară celei a testului 3T3 NRU, ceea ce poate explica utilizarea scăzută a acestui test recent.
model de epidermă umană 3D in vitro. Pentru a depăși limitările metodelor bazate pe celule in vitro, modelul de epidermă reconstituită 3D este investigat pentru aplicarea la testele de fototoxicitate (35,36). Practic, principiul testului este similar cu testul 3T3 NRU, și anume evaluarea diferenței de viabilitate tisulară între prezența și absența iradierii UV/VIS. Poate fi utilizat un model de predicție Similar care utilizează PIF și MPE (37). Cu toate acestea, în modelul epidermei 3D pot fi testate materiale insolubile în apă și se păstrează o anumită măsură a capacității metabolice în keratinocitele primare din stratul epidermic care pot fi aplicate substanțelor toxice care necesită activare metabolică (38). În plus, sunt posibile măsurători ale producției de citokine, cum ar fi IL-1 inkt (interleukina-1 inkt) (39), testul comet (40) și examinarea histologică, care pot fi luate în considerare în evaluarea ulterioară a fotoalergenicității și fotocarcinogenității.
metode in vivo care utilizează cobai, șoarece sau șobolani pigmentați. Animalele de laborator, cum ar fi șoarecii și cobaiii, sunt folosite pentru a simula scenariul real al fototoxicității umane. Animalele sunt expuse la substanțe chimice topic sau sistemic și iradiate cu o doză adecvată de UVA [în general 10 J/cm2 pentru testul la cobai, 20 J/cm2 pentru testul la șoarece (41)]. Scorul eritemului și edemului de la 0 la 4 este însumat și scorul maxim pe parcursul a 72 de ore de observație este mediu pe animal pentru a genera indicele de iritare. Indicele de fototoxicitate se obține prin ecuația” Indicele de iritație al indicelui de iritație UVA-iradiat – iritație al sitului neiradiat ” (42). Indicele de fototoxicitate peste 0,6 indică potențialul de fototoxicitate. Alternativ, grosimea urechii poate fi măsurată pentru a estima edemul în testele de șoarece. Aceste teste in vivo reflectă bine procesul fiziopatologic de fototoxicitate la om, dar sacrificiile animalelor, cheltuielile și timpul necesar pentru efectuarea testului ridică multe probleme, în special în era conștientizării pe scară largă a bunăstării și eticii animalelor. Testele de fototoxicitate Non-animale câștigă popularitate în aceste zile pentru a depăși aceste probleme (43).
în metodele chemico pentru evaluarea fototoxicității. Metodele de testare fără celule, și anume în chemico, au fost explorate pentru a evalua fototoxicitatea. Informațiile privind absorbția luminii și fotostabilitatea articolului testat au fost analizate pentru a prezice fototoxicitatea (44). Folosind generarea de specii reactive de oxigen în timpul fotoexcitării și fotoreacției ulterioare, potențialul fototoxic al unei substanțe chimice poate fi evaluat în chemico(12). Oxigenul Singlet este detectat prin albirea p-nitrosodimetilanilinei (RNO) în timp ce testul Nitro Albastru-Tetrazoliu (reacția NBT-formazan) este utilizat pentru a determina generarea de peroxid așa cum este descris mai jos (24),
-
singlet oxygen + imidazol
-
→ → imidazol oxidat
-
+ RNO
-
→ RNO albire + produse
testul de generare ROS a prezentat sensibilitatea și specificitatea de 90% și 76,9% pentru produse cosmetice și 100% și 75% pentru produse chimice non-cosmetice. Activitatea de rupere a catenei ADN este un alt mod de a evalua FOTOTOXICITATEA indusă de UV a diferitelor tipuri de substanțe chimice sau medicamente din chemico prin cuantificarea ADN-ului circular deschis sau închis. Acest test nu necesită, de asemenea, celule sau țesuturi vii, ci plasmidă. Plasmida este dizolvată în tampon și amestecată cu articole de testare. După ce amestecul a fost iradiat cu UV, probele sunt supuse electroforezei. Cantitatea de ADN de rupere este analizată prin tehnologie bazată pe fluorescență. Compusul fototoxic indus de UV are ca rezultat deschiderea catenelor ADN și depinde de concentrația medicamentului și de doza de iradiere UV (33). Aceste teste nu necesită celule vii sau țesuturi care pot adăuga variabilitatea rezultatelor testelor. Cu toate acestea, aceste metode au limitări care includ lipsa capacității de activare metabolică, inaplicabilitatea materialelor insolubile în apă (uleiuri, solide, geluri, produse formulate) și incapacitatea de a prezice fotogenotoxicitatea, fotoalergia(fotosensibilizarea) sau fotocarcinogenitatea. Acest test este limitat la identificarea pericolelor, nu pentru o evaluare a potenței fototoxice.