testmetoder for fototoksicitet og DYREALTERNATIVER
det er vigtigt at sikre kemikaliers fotosikkerhed, når der er risiko for eksponering af mennesker, hvilket klart kan eksemplificeres af lægemidler (20) eller kosmetik (21). For at evaluere potentialet for fototoksicitet af et kemikalie er der indført forskellige testmetoder, der spænder fra in silico(22), i chemico(23), in vitro til in vivo-analyse. I chemico-analyser som ROS generation (24) er in vitro-test, der inkluderer 3T3 NRU-analyse og 3D-epidermis-model, og in vivo-undersøgelser, der anvender marsvin, mus eller pigmenterede rotter, blevet udviklet og rutinemæssigt anvendt (25).
lyskilde til fototoksicitet. Lyskilde for fototoksicitet er ekstremt vigtig, da bølgelængder absorberet af testkemikaliet (absorptionsspektrum) og lysdosis (opnåelig inden for en rimelig eksponeringstid) bør være tilstrækkelige til at inducere fototoksicitet (26). Solsimulatorer, der simulerer naturligt sollys, betragtes som den ideelle kunstige lyskilde (Fig. 5).
bestrålingseffektfordelingen af den filtrerede solsimulator skal være tæt på den udendørs dagslys. Solar simulatorer er udstyret med ksenon buer eller (doteret) kviksølv-metalhalogenid buer. De skal også filtreres passende for at dæmpe de stærkt cytotoksiske UVB-bølgelængder. Spektret registreret under disse filtre bør ikke afvige fra standardiseret udendørs dagslys (specifikation: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
ikke desto mindre kan anden UVA-lyskilde som UVA-lampe også bruges med et korrekt UV-dosimeter til at kontrollere intensiteten og bølgelængden. Intensiteten af lys (bestråling) varierer afhængigt af kilderne, og det bør kontrolleres regelmæssigt før hver fototoksicitetstest ved hjælp af en passende bredbånd UV-meter. UV-måleren skal være kalibreret før hver måling. Bestrålingstid afhænger derfor af lyskildens intensitet (f.eks. for 1,7 MVM/cm2 lyskilde er 50 min eksponeringstid nødvendig for at opnå 5 J/cm2). Bestrålingstiden varierer også afhængigt af testmetoderne. En dosis på 5 J / cm2 (målt i Uva-området) blev bestemt til at være ikke-cytotoksisk, men tilstrækkelig potent til at ophidse kemikalier til at fremkalde fototoksiske reaktioner i 3T3 Neutral rød optagelsesassay.
3T3 Neutral rød optagelse assay. 3T3 Nru assay er blevet officielt godkendt af OECD og godkendt som OECD TG432 i 13th April 2004 (3). Denne test evaluerer fotocytotoksicitet ved at bestemme den relative reduktion i cellelevedygtighed efter eksponeringen for testartiklen i nærvær versus fravær af UV/VIS-bestråling. Beslutning om at gennemføre 3T3 Nru-fototoksicitetstest træffes for de kemikalier, der viser absorptionsspektre i UV/VIS-regionen, når de opløses i passende opløsningsmiddel (17). Det er blevet foreslået, at hvis den molære udryddelses−/absorptionskoefficient er mindre end 10 liter mol−1 cm-1, er det usandsynligt, at kemikaliet er fotoreaktivt (f.eks. i UV-kuvette med en 1 cm lang lyssti, skal OD på 0,05 M opløsning være mindre end 0,5 for at blive betragtet som ikke-fotoreaktivt baseret på ligningen “absorbans = udryddelseskoefficient * banelængde * koncentration”) (26). 3T3 NRU-test udviser meget følsom, men lav specifik forudsigelseskapacitet (en følsomhed på 93% og en specificitet på 84%). 3T3 NRU test har mange begrænsninger. Det kan ikke forudsige andre bivirkninger end foto(cyto)toksicitet, der kan opstå som følge af kombineret virkning af et kemikalie og lys, såsom fotogenotoksicitet, fotoallergi(fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. 3T3 NRU-test anvendes kun til fareidentifikation, mens dens anvendelighed til vurdering af fototoksisk styrke ikke er berettiget.Især mangler dette analysesystem metabolisk aktivitet, som er kritisk i manifestationen af systemisk udsatte kemikalier. Derfor anbefales in vivo dyreforsøg til systemisk eksponerede kemikalier, der kræver metabolisk aktivering som monokrotalin, riddelliin og heliotrin (pyrrolisidinalkaloider) (28) (5,29).
grundlæggende testprincip for 3T3 NRU er sammenligningen af cellelevedygtighed i nærvær eller fravær af UV/Vis-bestråling som bestemt med vitalt farvestof, neutral rød, som er et svagt kationisk farvestof, der let trænger ind i cellemembraner og akkumuleres intracellulært i lysosomer af levedygtige celler. Base cell-line er Balb / c 3T3 celle, som er mus fibroblast udviklet fra mus embryoner af G. T. Todaro i 1968. 3T3 betegnelse står for “3-dages overførsel, inokulum 3 til 105 celler” i 20 cm2 skål, og denne celle er relativt stabil, let tilgængelig og nem at håndtere (30). Dermal fibroblast er en af målceller med fototoksicitet, der giver en solid begrundelse for ansættelsen af 3T3 celler.
for at afgøre, om testartiklen er fototoksisk eller ej i 3T3 NRU-assay, skal koncentrationsresponsen opnås ved tilstedeværelse og fravær af bestråling. Foto-irritationsfaktor (PIF) eller gennemsnitlig fotoeffekt (MPE) beregnes (31). PIF er forholdet mellem IC50 (koncentration, der nedsætter cellelevedygtigheden med 50%) af ikke-bestrålet over bestrålet som vist i Fig. 7.
når IC50 ikke kan opnås, beregnes MPE som følgende ligning
PIF < 2 eller en MPE < 0.1 forudsiger: “ingen fototoksicitet”. En PIF > 2 og < 5 eller en MPE > 0,1 og < 0,15 forudsiger: “sandsynlig fototoksicitet” og PIF > 5 eller en MPE > 0,15 forudsiger: “fototoksicitet” (Fig. 8).
erythrocyt hæmolyse test. Cellemembraner er sårbare over for fotokemisk genererede ROS og radikaler. Uva-inducerede skader på erytrocyt og resulterende hæmolyse (photohemolysis)aktiveres for at vurdere fototoksisk potentiale i testartikler (32). Får røde blodlegemer (SRBC) inkuberes med kemikalier og bestråles med UVA ved 20 J/cm2. Efter bestråling blev Srbc ‘ er inkuberet i mørke i 2 timer ved stuetemperatur og derefter i yderligere 1 time ved 37 liter, hvorefter hæmolyse blev målt med Drabkins reagens og måling af UV-absorbans ved 540 nm. Omfanget af fototoksicitet blev vurderet ved frigivelse af hæmoglobin fra SRBC, dvs.fotohæmolytisk aktivitet som efter ligning (33).
-
Ade: optisk tæthed af eksponeret lægemiddelopløsning med erythrocytter
-
AD: optisk tæthed af eksponeret lægemiddelopløsning uden erythrocytter
-
C: optisk tæthed af 100% hæmolytisk kontrolopløsning
Fotohæmolytisk aktivitet øges markant ud over 20% ved 100 liter / mL. Følsomheden, specificiteten og nøjagtigheden af denne test var henholdsvis 67%, 73% og 73% for 24 kemikalier (8 duftstoffer, 5 UV-absorbenter, 4 lægemidler, 4 antimikrobielle stoffer og 3 farvestoffer) sammenlignet med in vivo marsvintest (34). Lav følsomhed kan være problematisk, og dens ydeevne er meget ringere end 3T3 NRU-testen, hvilket kan forklare den nedsatte brug af denne test for nylig.
in vitro human 3D epidermis model. For at overvinde begrænsningerne af in vitro cellebaserede metoder undersøges 3D rekonstrueret epidermis model til anvendelse på fototoksicitetstest (35,36). Grundlæggende svarer testprincippet til 3T3 NRU-test, nemlig vurderingen af forskellen i vævs levedygtighed mellem I nærvær og fravær af UV/VIS-bestråling. Lignende forudsigelsesmodel, der anvender PIF og MPE, kan anvendes (37). I 3D-epidermis-modellen kan vanduopløselige materialer imidlertid testes, og en vis grad af metabolisk kapacitet bevares i de primære keratinocytter i det epidermale lag, der kan påføres de toksiske stoffer, der kræver metabolisk aktivering (38). Desuden er måling af cytokinproduktion som IL-1-kur (Interleukin-1-kur) (39), kometanalyse (40) og histologisk undersøgelse mulig, som kan overvejes i den videre evaluering af fotoallergenicitet og fotokarcinogenecity.
in vivo metoder, der anvender marsvin, mus eller pigmenterede rotter. Laboratoriedyr som mus og marsvin anvendes til at simulere det virkelige scenarie af menneskelig fototoksicitet. Dyr udsættes for kemikalier topisk eller systemisk og bestråles med passende dosis UVA (generelt 10 J/cm2 til marsvintesten, 20 J/cm2 til musetest (41)). Scoring af erytem og ødem fra 0 til 4 opsummeres, og maksimal score i løbet af 72 timers observation beregnes i gennemsnit pr. Fototoksicitetsindeks opnås ved ligningen” Irritationsindeks for UVA-bestrålet Irritationsindeks for ikke – bestrålet sted ” (42). Fototoksicitetsindeks over 0,6 angiver potentialet for fototoksicitet. Alternativt kan øretykkelsen måles for at estimere ødem i musetest. Disse in vivo-test afspejler godt den patofysiologiske proces med fototoksicitet hos mennesker, men ofre af dyr, udgifter og tid, der kræves for at gennemføre testen, udgør mange problemer, især i en tid med bred bevidsthed om dyrevelfærd og etik. Ikke-dyrebaserede fototoksicitetstest vinder popularitet i disse dage for at overvinde disse problemer (43).
i kemiske metoder til vurdering af fototoksicitet. Cellefri reagensglasmetoder, nemlig i kemi, er blevet undersøgt for at vurdere fototoksicitet. Oplysninger om lysabsorbans og fotostabilitet af testartikel er blevet analyseret for at forudsige fototoksicitet (44). Ved anvendelse af dannelsen af reaktive iltarter under fotoekspression og efterfølgende fotoreaktion kan et kemikalies fototoksiske potentiale evalueres i chemico(12). Ved hjælp af p-nitrosodimethylanilin (RNO) blegning, mens Nitroblåttrasoliumtest (NBT-formasanreaktion) anvendes til at bestemme generering af overilte som vist nedenfor (24),
-
Sildenafil
-
→ → diphenidin
-
+ RNO
-
→ RNO blegning + produkter
ROS generation assay udviste følsomhed og specificitet på 90% og 76,9% for kosmetik og 100% og 75% for ikke-kosmetiske kemikalier. DNA-strengbrudsaktivitet er en anden måde at evaluere UV-induceret fototoksicitet af forskellige slags kemikalier eller lægemidler i chemico ved at kvantificere åbent eller lukket cirkulært DNA. Dette assay kræver heller ikke levende celler eller væv, men plasmid. Plasmid opløses i buffer og blandes med testartikler. Efter at blandingen er blevet bestrålet med UV, underkastes prøver elektroforese. Mængden af brud DNA analyseres ved hjælp af fluorescerende baseret teknologi. UV-induceret fototoksisk forbindelse resulterer i åbning af DNA-strenge, og det afhænger af lægemiddelkoncentration og UV-bestrålingsdosis (33). Disse tests kræver ikke levende celler eller væv, der kan øge variabiliteten af testresultater. Imidlertid har disse metoder begrænsninger, der inkluderer manglende metabolisk aktiveringskapacitet, uanvendelighed af vanduopløselige materialer (olier, faste stoffer, geler, formulerede produkter) og manglende evne til at forudsige fotogenotoksicitet, fotoallergi(fotosensibilisering) eller fotokarcinogenicitet. Denne test er begrænset til fareidentifikation, ikke til vurdering af fototoksisk styrke.