MÉTHODES D’ESSAI DE PHOTOTOXICITÉ ET MÉTHODES D’essai ALTERNATIVES ANIMALES
Il est essentiel d’assurer la photosécurité des produits chimiques lorsqu’il existe des risques d’exposition humaine, comme en témoignent clairement les produits pharmaceutiques (20) ou les cosmétiques (21). Pour évaluer le potentiel de phototoxicité d’un produit chimique, diverses méthodes d’essai allant de in silico (22), in chemico (23), in vitro à in vivo, ont été introduites. Dans des essais chimiques tels que la génération de ROS (24), des tests in vitro comprenant un test NRU 3T3 et un modèle d’épiderme 3D, ainsi que des études in vivo utilisant des cobayes, des souris ou des rats pigmentés ont été développés et utilisés de manière routinière (25).
Source de lumière pour la phototoxicité. La source lumineuse pour la phototoxicité est extrêmement importante car les longueurs d’onde absorbées par le produit chimique d’essai (spectre d’absorption) et la dose de lumière (réalisable dans un temps d’exposition raisonnable) devraient être suffisantes pour induire une phototoxicité (26). Les simulateurs solaires qui simulent la lumière naturelle du soleil sont considérés comme la source de lumière artificielle idéale (Fig. 5).
La distribution de puissance d’irradiation du simulateur solaire filtré doit être proche de celle de la lumière du jour extérieure. Les simulateurs solaires sont équipés d’arcs au xénon ou d’arcs halogénures de mercure-métal (dopés). Ils doivent également être filtrés de manière appropriée pour atténuer les longueurs d’onde UVB hautement cytotoxiques. Le spectre enregistré sous ces filtres ne doit pas s’écarter de la lumière du jour extérieure normalisée (Spécification: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Néanmoins, d’autres sources de lumière UVA comme la lampe UVA peuvent également être utilisées avec un dosimètre UV approprié pour vérifier l’intensité et la longueur d’onde. L’intensité de la lumière (irradiance) varie en fonction des sources et doit être régulièrement vérifiée avant chaque test de phototoxicité à l’aide d’un UV-mètre à large bande adapté. L’UV-mètre doit avoir été étalonné avant chaque mesure. En conséquence, le temps d’irradiation dépend de l’intensité de la source lumineuse (par exemple, pour une source lumineuse de 1,7 mW / cm2, un temps d’exposition de 50 minutes est nécessaire pour atteindre 5 J / cm2). Le temps d’irradiation varie également en fonction des méthodes d’essai. Une dose de 5 J / cm2 (mesurée dans la gamme des UVA) s’est avérée non cytotoxique, mais suffisamment puissante pour exciter des produits chimiques pour provoquer des réactions phototoxiques dans le test d’absorption du rouge neutre 3T3.
Test d’absorption du rouge neutre 3T3. Le test NRU 3T3 a été officiellement approuvé par l’OCDE et approuvé sous le nom d’OCDE TG432 le 13 avril 2004 (3). Cet essai évalue la photocytotoxicité en déterminant la réduction relative de la viabilité cellulaire après l’exposition à l’article d’essai en présence par rapport à l’absence d’irradiation UV/VIS. La décision d’effectuer un essai de phototoxicité du NRU 3T3 est prise pour les produits chimiques qui présentent des spectres d’absorption dans la région UV / VIS lorsqu’ils sont dissous dans un solvant approprié (17). Il a été suggéré que si le coefficient d’extinction/ absorption molaire est inférieur à 10 litres x mol−1 x cm−1, il est peu probable que le produit chimique soit photoréactif (par exemple, dans une cuvette UV avec un trajet lumineux de 1 cm de long, la DO d’une solution de 0,05 M soit inférieure à 0,5 pour être considérée comme non photoréactive sur la base de l’équation « absorbance = coefficient d’extinction x longueur du trajet x concentration ») (26). Le test NRU 3T3 présente une capacité prédictive spécifique très sensible mais faible (une sensibilité de 93% et une spécificité de 84%). Le test NRU 3T3 présente de nombreuses limitations. Il ne peut pas prédire les effets indésirables autres que la phototoxicité (cyto) pouvant résulter de l’action combinée d’un produit chimique et de la lumière, tels que la photogénotoxicité, la photoallergie (photosensibilisation) ou la photocarcinogénicité. L’essai NRU 3T3 n’est utilisé que pour l’identification des dangers, alors que son utilité pour l’évaluation de la puissance phototoxique n’est pas justifiée.En particulier, ce système de dosage manque d’activité métabolique, ce qui est essentiel dans la manifestation de produits chimiques exposés au système. Par conséquent, pour les produits chimiques exposés au système qui nécessitent une activation métabolique comme la monocrotaline, la riddelliine et l’héliotrine (alcaloïdes pyrrolizidiniques) (28), des études in vivo sur des animaux sont recommandées (5,29).
Le principe de test fondamental du NRU 3T3 est la comparaison de la viabilité cellulaire en présence ou en absence d’irradiation UV / Vis telle que déterminée avec un colorant vital, le rouge neutre, qui est un colorant cationique faible qui pénètre facilement dans les membranes cellulaires et s’accumule intracellulairement dans les lysosomes de cellules viables. La lignée cellulaire de base est la cellule Balb / c 3T3, qui est un fibroblaste de souris développé à partir d’embryons de souris par G.T. Todaro en 1968. La désignation 3T3 signifie « transfert de 3 jours, inoculum 3 × 105 cellules » dans une boîte de 20 cm2, et cette cellule est relativement stable, facilement disponible et facile à manipuler (30). Le fibroblaste cutané est l’une des cellules cibles de phototoxicité fournissant une justification solide pour l’emploi de cellules 3T3.
Pour déterminer si l’article d’essai est phototoxique ou non dans le test NRU 3T3, la concentration-réponse doit être obtenue en présence et en l’absence d’irradiation. Le Facteur de Photo-Irritation (PIF) ou l’Effet Photo Moyen (MPE) doivent être calculés (31). PIF est le rapport d’IC50 (concentration qui diminue la viabilité cellulaire de 50%) de non irradié sur irradié comme le montre la Fig. 7.
Lorsque IC50 ne peut pas être obtenu, MPE est calculé comme suit équation
PIF < 2 ou un MPE < 0,1 prédit: « pas de phototoxicité ». Un PIF >2 et < 5 ou un MPE > 0,1 et < 0,15 prédit : « phototoxicité probable » et un PIF > 5 ou un MPE > 0,15 prédit: « phototoxicité » (Fig. 8).
Test d’hémolyse érythrocytaire. Les membranes cellulaires sont vulnérables aux ROS et aux radicaux générés photochimiquement. Les dommages induits par les UVA des érythrocytes et l’hémolyse qui en résulte (photohémolyse) sont capitalisés pour évaluer le potentiel phototoxique des articles d’essai (32). Les globules rouges de mouton (SRBC) sont incubés avec des produits chimiques et irradiés avec des UVA à 20 J/cm2. Après irradiation, les SRBC ont été incubés dans l’obscurité pendant 2 heures à température ambiante, puis pendant encore 1 heure à 37 ℃, après quoi l’hémolyse a été mesurée avec le réactif de Drabkin et la mesure de l’absorbance UV à 540 nm. L’étendue de la phototoxicité a été évaluée par la libération d’hémoglobine par SRBC, c’est-à-dire l’activité photohémolytique, selon l’équation (33).
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ADE: densité optique de la solution médicamenteuse exposée avec des érythrocytes
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AD: densité optique de la solution médicamenteuse exposée sans érythrocytes
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C: densité optique de la solution de contrôle hémolytique à 100%
Les phototoxicants comme la ciprofloxacine, la norfloxacine ou l’énoxacine augmentent significativement l’activité photohémolytique au-delà de 20% à 100 µg/mL. La sensibilité, la spécificité et la précision de ce test étaient respectivement de 67%, 73% et 73% pour 24 produits chimiques (8 parfums, 5 absorbeurs d’UV, 4 médicaments, 4 antimicrobiens et 3 colorants) par rapport au test in vivo pour cobayes (34). Une faible sensibilité peut être problématique et ses performances sont bien inférieures à celles du test NRU 3T3, ce qui peut expliquer la diminution de l’utilisation de ce test récemment.
Modèle d’épiderme 3D humain in vitro. Pour surmonter les limites des méthodes cellulaires in vitro, un modèle d’épiderme reconstruit en 3D est à l’étude pour l’application aux tests de phototoxicité (35,36). Fondamentalement, le principe du test est similaire au test NRU 3T3, à savoir l’évaluation de la différence de viabilité tissulaire entre la présence et l’absence d’irradiation UV / VIS. Un modèle de prédiction similaire utilisant PIF et MPE peut être utilisé (37). Dans le modèle d’épiderme 3D, cependant, des matériaux insolubles dans l’eau peuvent être testés et une certaine capacité métabolique est préservée dans les kératinocytes primaires de la couche épidermique qui peuvent être appliqués sur les toxiques nécessitant une activation métabolique (38). De plus, il est possible de mesurer la production de cytokines comme l’IL-1β (Interleukine-1β) (39), le dosage des comètes (40) et l’examen histologique qui peuvent être pris en compte dans l’évaluation ultérieure de la photoallergénicité et de la photocarcinogénicité.
Méthodes in vivo utilisant des cobayes, des souris ou des rats pigmentés. Des animaux de laboratoire tels que des souris et des cobayes sont utilisés pour simuler un scénario réel de phototoxicité humaine. Les animaux sont exposés à des produits chimiques par voie topique ou systémique et irradiés avec une dose appropriée d’UVA (généralement 10 J /cm2 pour le test cobaye, 20 J /cm2 pour le test souris (41)). La notation de l’érythème et de l’œdème de 0 à 4 est additionnée et la note maximale pendant 72 heures d’observation est moyennée par animal pour générer un indice d’irritation. L’indice de phototoxicité est obtenu par l’équation « Indice d’irritation des sites irradiés par les UVA – Indice d’irritation des sites non irradiés » (42). Un indice de phototoxicité supérieur à 0,6 indique le potentiel de phototoxicité. Alternativement, l’épaisseur de l’oreille peut être mesurée pour estimer l’œdème lors de tests chez la souris. Ces tests in vivo reflètent bien le processus physiopathologique de phototoxicité chez l’homme, mais les sacrifices d’animaux, les dépenses et le temps nécessaires pour effectuer le test posent de nombreux problèmes, en particulier à l’ère de la sensibilisation généralisée au bien-être et à l’éthique des animaux. Les tests de phototoxicité non animaux gagnent en popularité ces jours-ci pour surmonter ces problèmes (43).
In chemico methods for phototoxicity evaluation. Des méthodes de tubes à essai sans cellules, notamment en chimie, ont été explorées pour évaluer la phototoxicité. Des informations sur l’absorbance de la lumière et la photostabilité de l’article d’essai ont été analysées pour prédire la phototoxicité (44). En utilisant la génération d’espèces réactives de l’oxygène pendant la photoexcitation et la photoréaction subséquente, le potentiel phototoxique d’un produit chimique peut être évalué dans chemico (12). L’oxygène singulet est détecté par blanchiment de la p-nitrosodiméthylaniline (RNO) tandis que le test Nitro Blue-Tetrazolium (réaction NBT-formazan) est utilisé pour déterminer la génération de peroxyde comme illustré ci-dessous (24),
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Oxygène singulet + imidazole
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→ → imidazole oxydé
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+ RNO
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→ Produits de blanchiment RNO +
Le test de génération de ROS a montré la sensibilité et la spécificité de 90% et 76,9% pour les cosmétiques et de 100% et 75% pour les produits chimiques non cosmétiques. L’activité de rupture des brins d’ADN est une autre façon d’évaluer la phototoxicité induite par les UV de différents types de produits chimiques ou de médicaments en chimie en quantifiant l’ADN circulaire ouvert ou fermé. Ce test ne nécessite pas non plus de cellules ou de tissus vivants, mais du plasmide. Le plasmide est dissous dans du tampon et mélangé avec des articles d’essai. Après irradiation du mélange aux UV, les échantillons sont soumis à une électrophorèse. La quantité d’ADN de rupture est analysée par une technologie à base de fluorescence. Le composé phototoxique induit par les UV ouvre des brins d’ADN et dépend de la concentration du médicament et de la dose d’irradiation UV (33). Ces tests ne nécessitent pas de cellules ou de tissus vivants qui peuvent ajouter à la variabilité des résultats des tests. Cependant, ces méthodes ont des limites qui incluent le manque de capacité d’activation métabolique, l’inapplicabilité des matériaux insolubles dans l’eau (huiles, solides, gels, produits formulés) et l’incapacité de prédire la photogénotoxicité, la photoallergie (photosensibilisation) ou la photocarcinogénicité. Cet essai se limite à l’identification des dangers et non à l’évaluation du pouvoir phototoxique.