PRÜFMETHODEN FÜR PHOTOTOXIZITÄT UND TIERISCHE ALTERNATIVEN
Es ist unerlässlich, die Photosicherheit von Chemikalien zu gewährleisten, wenn die Möglichkeit einer Exposition des Menschen besteht, wie dies bei Arzneimitteln (20) oder Kosmetika (21) deutlich gezeigt wird. Um das Potenzial der Phototoxizität einer Chemikalie zu bewerten, wurden verschiedene Testmethoden eingeführt, die von In silico (22), in chemico (23), in vitro bis hin zu In vivo Assays reichen. In chemischen Assays wie der ROS-Generation (24) wurden In-vitro-Tests mit 3T3-NRU-Assay und 3D-Epidermismodell sowie In-vivo-Studien mit Meerschweinchen, Mäusen oder pigmentierten Ratten entwickelt und routinemäßig verwendet (25).
Lichtquelle für Phototoxizität. Die Lichtquelle für die Phototoxizität ist äußerst wichtig, da die von der Prüfsubstanz absorbierten Wellenlängen (Absorptionsspektrum) und die Lichtdosis (erreichbar in einer angemessenen Expositionszeit) ausreichen sollten, um eine Phototoxizität zu induzieren (26). Sonnensimulatoren, die natürliches Sonnenlicht simulieren, gelten als ideale künstliche Lichtquelle (Abb. 5).
Die Bestrahlungsleistungsverteilung des gefilterten Solarsimulators sollte nahe an der des Tageslichts im Freien liegen. Solarsimulatoren sind mit Xenon-Lichtbögen oder (dotierten) Quecksilber-Metallhalogenid-Lichtbögen ausgestattet. Sie sollten auch geeignet gefiltert werden, um die stark zytotoxischen UVB-Wellenlängen zu dämpfen. Das unter diesen Filtern aufgezeichnete Spektrum sollte nicht vom standardisierten Tageslicht im Freien abweichen (Spezifikation: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Dennoch können andere UVA-Lichtquellen wie UVA-Lampen auch mit einem geeigneten UV-Dosimeter verwendet werden, um die Intensität und Wellenlänge zu überprüfen. Die Lichtintensität (Bestrahlungsstärke) variiert je nach Quelle und sollte vor jedem Phototoxizitätstest regelmäßig mit einem geeigneten Breitband-UV-Messgerät überprüft werden. Das UV-Messgerät muss vor jeder Messung kalibriert worden sein. Dementsprechend hängt die Bestrahlungszeit von der Intensität der Lichtquelle ab (z. B. sind für eine Lichtquelle von 1,7 mW / cm2 50 minuten Belichtungszeit erforderlich, um 5 J / cm2 zu erreichen). Die Bestrahlungszeit variiert auch in Abhängigkeit von den Testmethoden. Eine Dosis von 5 J / cm2 (gemessen im UVA-Bereich) erwies sich als nicht zytotoxisch, aber ausreichend wirksam, um Chemikalien anzuregen, phototoxische Reaktionen im 3T3-Neutralrot-Aufnahmetest auszulösen.
3T3 Neutraler roter Aufnahmetest. Der 3T3-NRU-Assay wurde von der OECD offiziell genehmigt und am 13.April 2004 als OECD TG432 bestätigt (3). Dieser Test bewertet die Photocytotoxizität durch Bestimmung der relativen Verringerung der Zelllebensfähigkeit nach der Exposition gegenüber dem Testgegenstand in Gegenwart oder Abwesenheit von UV / VIS-Bestrahlung. Die Entscheidung zur Durchführung eines 3T3 NRU-Phototoxizitätstests wird für die Chemikalien getroffen, die Absorptionsspektren im UV / VIS-Bereich zeigen, wenn sie in einem geeigneten Lösungsmittel gelöst werden (17). Es wurde vorgeschlagen, dass, wenn der molare Extinktions− / Absorptionskoeffizient weniger als 10 Liter x mol−1 x cm-1 beträgt, die Chemikalie wahrscheinlich nicht photoreaktiv ist (z. B. muss in einer UV-Küvette mit 1 cm langem Lichtweg der OD von 0,05 M Lösung kleiner als 0,5 sein, um basierend auf der Gleichung „Absorption = Extinktionskoeffizient x Weglänge x Konzentration“ als nicht photoreaktiv angesehen zu werden) (26). Der 3T3-NRU-Test zeigt eine hochempfindliche, aber geringe spezifische Vorhersagekapazität (eine Sensitivität von 93% und eine Spezifität von 84%). 3T3 NRU test hat viele einschränkungen. Es können keine anderen nachteiligen Wirkungen als die Photo- (Zyto-) Toxizität vorhergesagt werden, die sich aus der kombinierten Wirkung einer Chemikalie und des Lichts wie Photogenotoxizität, Photoallergie (Photosensibilisierung) oder Photokarzinogenität ergeben können. Der 3T3-NRU-Test wird nur zur Gefahrenidentifikation eingesetzt, während sein Nutzen für die Beurteilung der phototoxischen Wirksamkeit nicht gewährleistet ist.Insbesondere fehlt diesem Assaysystem eine metabolische Aktivität, die für die Manifestation systemisch exponierter Chemikalien kritisch ist. Daher werden für systemisch exponierte Chemikalien, die eine metabolische Aktivierung erfordern, wie Monocrotalin, Riddelliin und Heliotrin (Pyrrolizidinalkaloide) (28), In-vivo-Tierstudien empfohlen (5,29).
Das grundlegende Testprinzip von 3T3 NRU ist der Vergleich der Zelllebensfähigkeit in Gegenwart oder Abwesenheit von UV / Vis-Bestrahlung, bestimmt mit dem Vitalfarbstoff Neutralrot, einem schwachen kationischen Farbstoff, der leicht in Zellmembranen eindringt und sich intrazellulär in Lysosomen lebensfähiger Zellen ansammelt. Basiszelllinie ist Balb / c 3T3 Zelle, die Maus Fibroblasten aus Mausembryonen von G. T. Todaro im Jahr 1968 entwickelt wird. 3T3 Bezeichnung steht für „3-Tage-Transfer, Inokulum 3 × 105 Zellen“ in 20 cm2 Schale, und diese Zelle ist relativ stabil, leicht verfügbar und einfach zu handhaben (30). Dermale Fibroblasten sind eine der Zielzellen der Phototoxizität, die eine solide Begründung für die Verwendung von 3T3-Zellen liefert.
Um zu entscheiden, ob der Prüfling im 3T3-NRU-Test phototoxisch ist oder nicht, ist das Konzentrations-Ansprechverhalten in Gegenwart und in Abwesenheit von Bestrahlung zu ermitteln. Es ist der Photo-Irritationsfaktor (PIF) oder der mittlere Photoeffekt (MPE) zu berechnen (31). PIF ist das Verhältnis von IC50 (Konzentration, die die Zelllebensfähigkeit um 50% verringert) von nicht bestrahltem zu bestrahltem, wie in Abb. 7.
Wenn IC50 nicht erhalten werden kann, wird MPE wie folgt berechnet Gleichung
PIF < 2 oder ein MPE < 0,1 sagt voraus: „keine Phototoxizität“. Ein PIF > 2 und < 5 oder ein MPE > 0,1 und < 0,15 sagt voraus: „wahrscheinliche Phototoxizität“ und PIF > 5 oder ein MPE > 0,15 sagt voraus: „Phototoxizität“ (Abb. 8).
Erythrozyten-Hämolysetest. Zellmembranen sind anfällig für photochemisch erzeugte ROS und Radikale. UVA-induzierte Schädigungen der Erythrozyten und daraus resultierende Hämolyse (Photohämolyse)wird aktiviert, um das phototoxische Potenzial von Testartikeln zu bewerten (32). Schafe rote Blutkörperchen (SRBC) werden mit Chemikalien inkubiert und mit UVA bei 20 J / cm2 bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden SRBCs im Dunkeln für 2 Stunden bei Raumtemperatur und dann für weitere 1 Stunde bei 37 ℃ inkubiert, wonach die Hämolyse mit Drabkins Reagenz und die Messung der UV-Absorption bei 540 nm gemessen wurden. Das Ausmaß der Phototoxizität wurde durch die Freisetzung von Hämoglobin aus SRBC, d. H. photohämolytische Aktivität, wie nach Gleichung (33) beurteilt.
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ADE: optische Dichte exponierter Arzneimittellösung mit Erythrozyten
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AD: optische Dichte der belichteten Arzneimittellösung ohne Erythrozyten
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C: optische Dichte von 100% hämolytischer Kontrolllösung
Phototoxika wie Ciprofloxacin, Norfloxacin oder Enoxacin erhöhen die photohämolytische Aktivität bei 100 µg / ml signifikant über 20% hinaus. Die Empfindlichkeit, Spezifität und Genauigkeit dieses Tests betrug 67%, 73% bzw. 73% für 24 Chemikalien (8 Duftstoffe, 5 UV-Absorber, 4 Arzneimittel, 4 antimikrobielle Mittel und 3 Farbstoffe) im Vergleich zum In-vivo-Meerschweinchentest (34). Niedrige Empfindlichkeit kann problematisch sein und seine Leistung ist viel schlechter als die des 3T3 NRU-Tests, was die verringerte Verwendung dieses Tests in letzter Zeit erklären kann.
In vitro menschliches 3D epidermis modell. Um die Grenzen zellbasierter In-vitro-Methoden zu überwinden, wird ein 3D-rekonstruiertes Epidermismodell für die Anwendung auf Phototoxizitätstests untersucht (35,36). Grundsätzlich ähnelt das Testprinzip dem 3T3 NRU-Test, nämlich der Beurteilung des Unterschieds der Gewebeviabilität zwischen An- und Abwesenheit von UV / VIS-Bestrahlung. Ein ähnliches Vorhersagemodell, das PIF und MPE verwendet, kann verwendet werden (37). Im 3D-Epidermismodell können jedoch wasserunlösliche Materialien getestet werden und ein gewisses Maß an metabolischer Kapazität bleibt in den primären Keratinozyten in der Epidermisschicht erhalten, die auf die toxischen Substanzen aufgebracht werden können, die eine metabolische Aktivierung erfordern (38). Darüber hinaus sind Messungen der Zytokinproduktion wie IL-1β (Interleukin-1β) (39), Comet-Assay (40) und histologische Untersuchungen möglich, die in die weitere Bewertung der Photoallergenität und Photokarzinogenität einfließen können.
In vivo Methoden mit Meerschweinchen, Mäusen oder pigmentierten Ratten. Labortiere wie Mäuse und Meerschweinchen werden eingesetzt, um reale Szenarien der menschlichen Phototoxizität zu simulieren. Die Tiere werden topisch oder systemisch Chemikalien ausgesetzt und mit einer geeigneten Dosis UVA bestrahlt (im Allgemeinen 10 J/cm2 für den Meerschweinchen-Test, 20 J/cm2 für den Maus-Test (41)). Die Bewertung von Erythemen und Ödemen von 0 bis 4 wird summiert und die maximale Punktzahl während 72 Stunden Beobachtung wird pro Tier gemittelt, um den Irritationsindex zu generieren. Der Phototoxizitätsindex wird durch die Gleichung „Irritationsindex der UVA-bestrahlten Stelle – Irritationsindex der nicht bestrahlten Stelle“ (42) erhalten. Der Phototoxizitätsindex über 0,6 zeigt das Potenzial der Phototoxizität an. Alternativ kann die Ohrdicke gemessen werden, um Ödeme in Mäusetests abzuschätzen. Diese In-vivo-Tests spiegeln den pathophysiologischen Prozess der Phototoxizität beim Menschen gut wider, aber Opfer von Tieren, Kosten und Zeitaufwand für die Durchführung des Tests werfen viele Probleme auf, insbesondere in Zeiten eines weit verbreiteten Bewusstseins für Tierschutz und Ethik. Nicht-tierische Phototoxizitätstests gewinnen heutzutage an Popularität, um diese Probleme zu überwinden (43).
In chemische Methoden zur Phototoxizitätsbewertung. Zellfreie Reagenzglasmethoden, nämlich in chemico, wurden untersucht, um die Phototoxizität zu bewerten. Informationen zur Lichtabsorption und Photostabilität des Testartikels wurden analysiert, um die Phototoxizität vorherzusagen (44). Unter Verwendung der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies während der Photoanregung und der anschließenden Photoreaktion kann das phototoxische Potential einer Chemikalie in chemico (12) bewertet werden. Singulettsauerstoff wird durch p-Nitrosodimethylanilin (RNO) -Bleichen nachgewiesen, während der Nitroblau-Tetrazolium-Test (NBT-Formazan-Reaktion) zur Bestimmung der Peroxidbildung wie unten dargestellt eingesetzt wird (24),
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Singulettsauerstoff + Imidazol
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→ → oxidiertes Imidazol
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+ RNO
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→ RNO Bleaching + Produkte
ROS Generation Assay zeigte die Sensitivität und Spezifität von 90% und 76,9% für Kosmetika und 100% und 75% für nicht-kosmetische Chemikalien. DNA-Strangbrechungsaktivität ist eine weitere Möglichkeit, die UV-induzierte Phototoxizität verschiedener Arten von Chemikalien oder Arzneimitteln in der Chemie durch Quantifizierung offener oder geschlossener zirkulärer DNA zu bewerten. Dieser Assay erfordert auch keine lebenden Zellen oder Gewebe, sondern Plasmid. Plasmid wird in Puffer gelöst und mit Testartikeln vermischt. Nach Bestrahlung des Gemisches mit UV werden Proben einer Elektrophorese unterzogen. Die Menge der Bruch-DNA wird mit fluoreszenzbasierter Technologie analysiert. UV-induzierte phototoxische Verbindung führt zu DNA-Strängen und ist abhängig von Wirkstoffkonzentration und UV-Bestrahlungsdosis (33). Diese Tests erfordern keine lebenden Zellen oder Gewebe, die zur Variabilität der Testergebnisse beitragen können. Diese Methoden weisen jedoch Einschränkungen auf, darunter mangelnde metabolische Aktivierungskapazität, Nichtanwendbarkeit von wasserunlöslichen Materialien (Öle, Feststoffe, Gele, formulierte Produkte) und Unfähigkeit zur Vorhersage von Photogenotoxizität, Photoallergie (Photosensibilisierung) oder Photokarzinogenität. Dieser Test ist auf die Gefahrenidentifikation beschränkt, nicht auf die Beurteilung der phototoxischen Wirksamkeit.