International Journal of Molecular Medicine

Introduction

iho toimii fysikaalisena ja kemiallisena esteenä sisäelimen ja ulkoympäristön välillä, joka koostuu mesodermaalisesta pohjanahasta ja ektodermaalisesta orvaskedestä. Vaikka nämä kaksi kerrosta toimivat eri tavoin, ne kommunikoivat eri tavoin ja eri tasoilla. Ihon elintärkeä estotoiminta tapahtuu pääasiassa sen ylemmässä kerrostuneessa orvaskedessä, joka koostuu proliferoivista tyvitumakkeista ja erilaistuneista suprabasaalisista keratinosyyteistä (1). Näiden toimintojen suorittamiseksi tyvikerroksen kantasolut pystyvät uusiutumaan koko elämän ajan, ja ne tuottavat tytärsoluja, jotka erilaistuvat (2). Näin ollen perus-keratinosyyttien proliferaation ja erilaistumisen välinen tasapaino on välttämätön epidermaalisen eheyden kannalta,ja se varmistaa normaalin fysiologisen toiminnan kannalta välttämättömän uusiutumisen. Kudoksen homeostaasin ylläpitämisen lisäksi orvaskeden ja karvatuppien sisällä asuvat kantasolut osallistuvat myös orvaskeden korjaamiseen vamman jälkeen (3,4).ihossa haavan paranemisen eri vaiheet kehittyvät dynaamisina vuorovaikutuksina epidermaalisten solujen, ihosolujen ja bonemarrow-johdettujen solujen välillä. Keratinosyytit edustavat kehon ”ensimmäistä linjaa” ulkoympäristöä vastaan. Siksi he ovat ensimmäisiä loukkaantuneita. Tulehdussytokiinien vapautumisen ja kollageenisäikeiden supistumisen myötä tyviepidermaaliset keratinosyytit aktivoituvat ja siirtyvät haava-alueelle, jossa ne lisääntyvät ja erilaistuvat, kunnes kudoksen solupitoisuus on uusiutunut (5). Useat havainnot ovat osoittaneet, että orvaskesi vaikuttaa ihon arpien patologiaan (6,7). Palovammapotilailla hypertrofiset arvet ilmaantuvat useammin, kun haavat paranevat toissijaisesti, kun taas varhainen ihonsiirto näyttää ehkäisevän arpien muodostumista (8). Funayama et aldemonstrated that keloid-derived fibroblasts co-cultured with keloid-derived keratinocytes were significantly more proliferativeand resistent to apoptosis than those co-scultured with normalskin-derived keratinocytes (9).in a similar co-Cultured system, Se was found that keloid-derivedkeratinocytes promoted increased collagen production, as well as the increased proliferation of normal fibroblasts (10). Erityisesti keloidijohdannaisillakeratinosyyteillä on osoitettu olevan lisääntynyt DNA: n replikaation kannalta välttämättömien histonigeenien ekspressio verrattuna normaalien solujen ekspressiotasoihin, ja hypertrofisten arpien orvaskeden kloratinosyyteillä on tullut vaihtoehtoinen erilaistumisreitti ja ne ilmentävät proliferatiivista tyyppiä (11,12). Nämä tulokset viittaavat siihen, että keratinosyyttien proliferaation ja erilaistumisen välinen tasapaino on arpikudoksissa häiriintynyt, ja että keratinosyyttien fundamentalabnormaliteetit voivat olla tärkeämmässä roolissa uudistumisessa ja sen patogeneesissä kuin aiemmin arvostettiin.

tässä tutkimuksessa saatiin normaalit, haavan reuna-ja hypertrofiset arpikudokset, ja ne analysoitiin käyttäen histologisia ja immunofluoresenssimenetelmiä morfologisten erojen tutkimiseksi sekä keratiinin ilmentymisprofiileja epidermaalisen uudistumisen aikana. Tuloksemme osoittivat, että epidermalkeratinosyyttien keratiiniekspressioprofiileissa oli vaihtelua normaalista, haavan reunasta ja hypertrofisesta arpikudoksesta, mikä vastasi poikkeavuuksia kellarikalvon (BM) rakenteessa. Käyttämällä BMC-yhdisteiden vasta-ainepaneelia vahvistimme hypoteesimme ja määritimme, että BMV oli positiivinen säätelijä esiasteiden kaltaisten solujen rekrytoinnissa orvaskeden tyvikerrokseen. Tietojemme mukaan muutokset BM: n rakenteessa edistävät basaalikeratinosytoosia ottamaan käyttöön proliferatiivisen fenotyypin sekä in vivo että invitro.

materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteet

hypertrofinen arpikudos (4 naarasta ja 3 miestä; Ikä 18-40 vuotta) ja haavan reunakudos (3 naarasta ja 5 miestä;ikäjakauma 18-40 vuotta) otettiin potilailta, joilta ei ollut aiemmin tehty rekonstruktiivista palovammaleikkausta. Verrokkina käytettiin normaalia ihokudosta (4females ja 3 urosta; ikähaarukka, 18-40 vuotta) leikkauksen aikaisen scarexcisionin vieressä. Esinahkoja saatiin myös ympärileikkauksen läpikäyneiltä uroksilta (10 urosta; ikäjakauma,18-20 vuotta). Kiinan PLA General Hospitalin (Peking, Kiina) eettinen komitea hyväksyi tämän tutkimuksen, ja kaikilta ennen näytteitä ottaneilta henkilöiltä saatiin kirjallinen suostumus.

Immunofluoresenssivärjäys

normaalit ihon, haavan reunan ja hypertrofisten arpikudosten näytteet vahvistettiin 10-prosenttisesti puskuroidussa formaliiniliuoksessa, dehydratoidussa troughetanoliliuoksessa, jonka pitoisuus kasvoi peräkkäin, ja lopuksi upotettiin parafiiniin. Parafiinisubstraatit leikattiin 4-µm paksuisiin lohkoihin värjäykseen hematoksyliinillä ja eosiinilla (H&E), Massonin trikromilla ja metenamiinihopealla (kaikki peräisin Zhongshan Golden Bridgestä Pekingistä Kiinasta). Kuvat otettiin optisella mikroskoopilla (Bx53; Olympus, Tokio, Japani). Immunofluoresenssivärjäyksen suorittamiseksi nämä jaksot vahvistettiin 4%: ssa paraformaldehydiä 30 minuutin ajan ja sitten 0,2%: ssa Triton X-100: aa (T8787; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) 10 minuutin ajan. Näitä soluja inkuboitiin primaarisilla anti-elimillä 4°C: n lämpötilassa yön yli ja sen jälkeen sekundaarisilla vasta-aineilla 2 tunnin ajan huoneenlämmössä. Seuraavat ensisijaiset anti-elimet käytettiin: mouse anti-humancytokeratiini (CK)10 (1:200, ab111447) ja rabbit Anti-human CK14(1:200, ab7800) (molemmat abcam, Cambridge, MA, USA), rabbitanti-human CK5 (1:200, ZA-0518; Zhongshan Goldenbridge, Peking,Kiina), mouse anti-human CK19 (1:200, ab53119; abcam), rabbitanti-Human integrin-β1 (1:200, pb0063; Boster, Wuhan, Kiina); MOUSEANTI-Human integrin-β4 (1:200, ab128068; ABCAM), hiiren Anti-humanlaminiini (1:200, ZM-0181; Zhongshan Goldenbridge), rabbit anti-humanlamin-5 (1:200, ab14509; Abcam) ja mouse anti-human collagen IV(1:200, ZM-0081; Zhongshan Goldenbridge). Seuraavia toisiintumisasteita käytettiin: Alexa-Fluor 488-konjugoitu anti-hiiri (1:200,ab150117) ja Alexa-Fluor 594-konjugoitu Anti-kani (1:200,ab150080) (molemmat abcam: lta). Ytimet värjättiin dapilla (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).Immunofluoresenssikuvat otettiin konfokaalisella laserscanning-mikroskoopilla (SP8; Leica, Solms, Saksa).

Soluviljely ja hoito

ihmisen primaariset epidermaaliset keratinosyytit (HEKs) eristettiin uroksen esinahasta edellä kuvatulla tavalla (13) pienin muutoksin. Ihmisimmortalisoidut keratinosyyttisolut (HaCaT) ostettiin solulinjan resurssien (3111c0001cc000373;Peking, Kiina) infrastruktuurista. Sekä HEKs että HaCaT-solut inkuboitiin EpiLife Mediumissa (M-EPI-500-CA; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) täydennettynä 0, 06 mM Ca2+, 1% EpiLife määritelty kasvulisä (S-001-5; Invitrogen LifeTechnologies) ja 1% penisilliiniä/streptomysiiniä (P1400; Solarbio,Peking, Kiina). Tutkittaessa BM: n roolia keratinosyyttien käyttäytymisen säätelyssä in vitro heks-ja HaCaT-solut pinnoitettiin 60 mm-astioissa, jotka on päällystetty MaxGel ECM: llä (E0282) ja Collagen type IV: llä (c7521) (molemmat Sigma-Aldrichista).Ca2+ – hoitoa varten soluja inkuboitiin Epilifemediumissa täydennettynä 1,5 mM Ca2+: lla 0, 12 ja 24 tunnin ajan.MaxGel ECM sisältää ihmisen solunulkoisen matriisin (ECM) komponentteja, kuten kollageeneja, laminiinia, fibronektiinia, tenassiinia ja elastiinia sekä useita proteoglykaaneja ja glykosaminoglykaaneja. Kontrolleina käytettiin soluja, joita ei käsitelty Ca2+: lla.

Käänteiskopioijaentsyymi-kvantitatiivinen (reaaliaikainen) PCR (RT-qPCR)

kokonais-RNA eristettiin soluista sen jälkeen, kun niille oli tehty erilaisia käsittelyjä käyttäen Trizolireagenssia(15596-026; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja sitten cDNA wassynthesisoitiin goscript-käänteiskopioijaentsyymiä (A5001).; Promega, Madison, WI, Yhdysvallat) valmistajan ohjeiden mukaan. QPCR-reaktiot suoritettiin GOTAQ qPCR Master Mixillä (A6001; Promega) käyttäen ABI 7500Real-Time PCR-järjestelmää ja-ohjelmistoa (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA). Reaktioprotokolla koostui seuraavista sykleistä: 95°c 15 sekunnin ajan, 55°C 30 sekunnin ajan ja 72°C 30 sekunnin ajan 40 syklistä PCR-vahvistusta.

Western blot-analyysi

kokonaisproteiini eristettiin soluista ja 20µg proteiinia liuotettiin substraattiliukoiseen puskuriin. Theproteins erotettiin sitten SDS-PAGE ja siirrettiin ontopolyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvot (IPFL00010; Millipore,Billerica, MA, USA). Blotit tutkittiin blottien estämisen jälkeen ensiasteisilla vasta-aineilla yön yli 4°C:ssa. länsiblottianalyysissä käytetyt vasta-aineet olivat ck10 (1:1000, ab111447), CK14(1:500, ab7800), CK19 (1: 500, ab53119), integriini-β4 (1:500, ab128068) ja hiiren Anti-human β-aktiinivasta-aine (1:5000, ab6276)(kaikki abcam: sta). Pesun jälkeen kalvot inkuboitiin sekundaarisilla vasta-aineilla, joita olivat vuohien kaniinivastainen ja vuohien ja hiiren IgG piparjuuriperoksidaasiin konjugoituna (sc-2004,1:1000; sc-2005, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,USA). Immunoreaktiiviset bändit havaittiin enhancedchemiluminescence (ECL)-pakkauksella (PE-0010-100; Solarbio, Peking, Kiina), ja ne kuvattiin ImageQuant LAS 4000-järjestelmällä (GE HealthcareBio-Sciences, Pittsburgh, USA).

tilastollinen analyysi

kaikki kokeet toistettiin vähintään 3 kertaa,ellei toisin ilmoitettu. Tiedot esitetään keskiarvona ±keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi tehtiin käyttäen SPSS 20.0-ohjelmistoa. Datavertailu suoritettiin riippumattoman opiskelijan t-testillä ja yksisuuntaisella ANOVALLA, jota seurasi LSDtest. P-arvon <0, 05 katsottiin osoittavan tilastollisesti merkittävää eroa.

tulokset

morfologiset erot normaaleissa haavan reunakudoksissa ja hypertrofisissa arpikudoksissa

ihon haavan korjaus on tarkka uudelleenmuodostumisprosessi, joka jakautuu klassisesti neljään päällekkäiseen vaiheeseen ja johon liittyy monien eri kudosten ja solulineagien vuorovaikutus (5). Kroonisissa haavoissa normaali paranemisprosessi kuitenkin keskeytyy, mikä johtaa patologiseen tulehduksen ja proteaasin kiertoon, joka johtaa patologisen arven kehittymiseen. Tässä tutkimuksessa,jossa arvioitiin ihon haavan paranemisen aikana regeneroivassapidermisissä tapahtuvia morfologisia muutoksia, saatiin näytteitä normaaleista, kasvavista ja hypertrofisista arpikudoksista rutiininomaisen h&E: n ja Massonin trikromivärjäyksen mukaisessa järjestyksessä. Muodollisissa ihonäytteissä ihon histologinen rakenne oli näkyvä, ja siinä näkyi orvaskeden ja verinahan kerroksia. Epidermiksissä oli 4-5 kerrosta, joissa keratinosyytit erilaistuivat ja kypsyivät vähitellen spinoosisoluiksi, rakeisiksi soluiksi ja maissisoluiksi niiden ulospääsyn aikana (Kuva. 1 A). Lisäksi pohjasermisissä fibroblastit muodostivat löyhää sidekudosta, joka oli runsassuuntaisia kollageenisäikeitä (Kuva.1D). Haavan reunaa ympäröivissä kudoksissa pideermi kuitenkin lisääntyi; se koostui useista morfologialtaan erillisistäkeratinosyyttikerroksista ja oli näkyvästi suurentunut (Kuva. 1B ja E). Dermiksen ja orvaskeden välissä on sormimaisia ulokkeita, jotka kasvattavat orvaskeden ja verinahan välistä kosketuspinta-alaa. Sekä normaali ja woundedge kudokset, basal keratinosyyttien järjestettiin rykmentedsingle kerros kuutiomainen tai matala columnar soluja, jotka yhdistettysinous solukerrosten edellä (kuva.1A ja B). Hypertrofisen arpikudoksen histologinen rakenne erosi normaalista ihokudoksesta siten, että siinä oli runsaasti verta ja paksu epidermaalinen kerros (viikuna. 1C ja F). Verinahka oli koostunut suureksi osaksi tiheästä, epäjärjestäytyneestä sidekudoksesta, joka sisältää runsaasti epäsäännöllisen muotoisia kollageenisäikeitä ja isomman diametrin (Kuva. 1). Histologisen rakenteen erojen selventämiseksi normaalien, haavan reunan ja hypertrofisten arpikudosten välillä tehtiin METENAMIINIHOPEATESTAUS, jolla arvioitiin BM: n muodostumista, mikä osoitti, että BM: n rakenne oli havaittavissa normaalin ja haavan reunan kudosten osissa (Kuva. 1G ja H). Arpikudoksissa BM-värjäystä ei kuitenkaan ollut (Kuva.1).

erot epidermaalisten keratinosyyttien ilmentymisessä epidermaalisissa keratinosyyteissä normaaleissa, haavan reunassa ja hypertrofisissa arpikudoksissa

ottaen huomioon morfologiset erot normaaleissa, haavan reunassa ja hypertrofisissa arpikudoksissa,tutkimme, esiintyikö tyvikeratinosyyteissä erilaista solukäyttäytymistä arpien muodostumisen aikana. Aluksi suoritimme immunofluoresenssivärjäystä ck10: n, CK14: n,CK5: n, CK19: n ja integriini-β1: n ilmentymisen havaitsemiseksi normaalin, haavan reunan ja kudoksen osissa. Aiemmissa tutkimuksissa on varmistettu, että CK10 on erilaistuneiden keratinosyyttien merkki, että CK14 ja CK5 ovat proliferoivien tyvikeratinosyyttien tai TAs: ien merkkiaineita ja että CK19 on aputatiivinen merkki epidermaalisista kantasoluista tai kantasoluista (14-17). Integriini-β1: n arvellaan olevan myös esiastesolujen amarkeri ihossa (18,19). Tuloksemme osoittivat, että ck10 esiintyi orvaskeden uloimmassa kerroksessa normaaleissa ja reunakudoksissa (Kuva. 2A andB), ja suprabassalissa, terminaalisesti differentioituvat solut hypertrofisen arpikudoksen orvaskedessä (Kuva. 2C). CK14 ilmaistiin sekä pohja-että suprabaskaalikerroksina kaikkien kolmen kudoksen ositetussa orvaskedessä (Kuva. 2D-F), ja siellä oli laaja ck14: n levinneisyys arpikudoksen monikerroksisessa epidermisissä (Kuva.2). CK5: n jakelukuvio oli samankaltainen kuin ofCK14: n (kuva. 2G-I), joka osoitti lisääntyvien solujen määrän lisääntyneen hyperproliferatiivisessa orvaskedessä. Integriini-β1 ja CK19 ilmaistiin normaalin orvaskeden tyvikerroksessa (Kuva. 2J ja M) ja tyvipinta-ja tyvipinta-kerrokset haavan reuna orvaskeden (Kuva. 2K ja N), mutta niitä ei havaittu hypertrofisten arpikudosten orvaskedessä (Kuva. 2L ja O). Kollektiivisesti nämä huomiot osoittavat, että basalkeratinosyyttien keratiiniekspressioprofiili erosi normaalien, haavan reunan jahypertrofisten arpikudosten välillä. Vaikka vähemmän CK19-ilmentäviä soluja havaittiin hypertrofisen arpikudoksen tyvi-ja suprabaskaalikerroksissa (Kuva.2P), proliferatiivinen fenotyyppi paljastui johtuen ck14: n ja CK5: n lisääntyneestä ilmentymisestä monikerroksisessa epidermisissä.

BM: n muuttunut rakenne edistää epidermaalisen keratinosytesiinin vivo

differentiaalista keratiiniekspressioprofiilia, sillä ECM ei ainoastaan ankkuroi kantasoluja vaan myös ohjaa niiden kohtaloa (20). Kuten edellä mainittiin, hypertrofisissa arpikudosnäytteissä ei näyttänyt esiintyvän BM: n historiallista rakennetta. Koska erot thekeratin expression profiileja basal kerros normaali, woundedge ja hypertrofinen arpi epidermis, sitten spekuloitiin, että thestructural poikkeavuuksia BM rooli säätelyssä thecell kohtalo päätös basal keratinosyyttien aikana haavan paranemista. Tämän hypoteesin tutkimiseksi suoritettiin immunofluoresenssivärjäys, joka visualisoi BM: n komponentit normaalissa, haavan reunassa ja hypertrofisessa arpikudosnäytteessä. Tuloksemme osoittivat, että collagen IV-ilmentymä havaittiin BM-alueella molemmissa normaaleissa (Kuva. 3A)ja haavan reuna (Kuva. 3B) kudokset. Hypertrofisten arpien orvaskedessä havaittiin kuitenkin BM: n kaltaisten rakenteiden muodostumista siten, että kollageeniekspressio puuttui (Kuva. 3C). Vaikka laminiinin ekspressio havaittiin kaikissa kolmessa kudostyypissä(Kuva. 3D-F), laminiini-5: n ja sen reseptorin integriini-β4: n kaksoislabellointi todensi edelleen, että BM: n rakenne muuttui hypertrofisten arpikudosten epidermisissä; sekä laminiini-5: n että integriini-β4: n negatiivinen värjäytyminen (viikunat.3I ja 4G-I) havaittiin verrattuna normaaliin (viikunat. 3G ja 4A-C) ja haavan reunakudokset (viikunat. 3H ja 4D-F). Näiden havaintojen perusteella on todennäköistä, että normaali BM vaikutti integriini-β1: tä ja CK19: ää ilmentävien solujen rekrytointiin normaalin ja reunaisen orvaskeden tyvikerroksessa. Poikkeavuudet BM-rakenteessa kuitenkin indusoivat basaalikeratinosyytit erilaistumaan ja hyväksymään aproliferatiivisen fenotyypin arpipatogeneesin aikana.

BM: n muuttunut rakenne edistää epidermalkeratinosyyttien proliferatiivista fenotyyppiä in vitro

BM: n tarjoama mekaaninen tuki määräytyy ensisijaisesti sen tyypin IV kollageenitelineen (21) mukaan, johon ristisilloittuvat nidogeenit integroivat laminiiniverkostot ja perlekaanioligomeerit, jotta levymäinen BM-kompleksi voidaan lopullisesti koota (22). Selventääksemme edelleen BM: n roolia epidermaalisen keratinosyyttikäyttäytymisen säätelyssä käytimme ihmisen BM-uutteesta johdettua ECM: ää viljelmäruokien päällystämiseksi, jotta voidaan hallita solumatriisin adheesiota. Kuten infig. 5, ECM-hallintotapa, joka liittyi integriini-β4-ilmaisun säätelyyn Heksissä(Kuva. 5A)ja HaCaT (Kuva. 5B) soluja, joita esiintyi plasmakalvostossa ja solumatriisin kiinnityskohdissa. Teimme myös western blot-analyysin, jossa tutkittiin integriini-β4: n proteiinitasoja epidermaalisissa solulinjoissa joko Ekmcoatingilla tai ilman. Aineistomme osoitti, että ECM-hoidetuissa ryhmissä oli havaittavissa korkeampia integriini-ß4-pitoisuuksia kuin kontrolliryhmissä, mikä vahvisti edelleen fluoresoivia immunosisältäviä löydöksiä(Kuva. 5c). Lisäksi HEKs-jahacat-solut vaihdettiin 1, 5 mMCa2+: a sisältävään väliaineeseen edellä kuvatun mukaisesti (23, 24). Ca2+ – hoidon jälkeen morfologiset muutokset molemmissa Heksissä (Kuva. 6A)ja HaCaT-solut (Kuva. 6B) havaittiin valomikroskoopilla, johon sisältyi solujen laajentuminen ja litistyminen.Ca2+ indusoi ck10: n (viikunat. 5D, G ja J sekä 6C ja D) ja KK14 (viikunat. 5E, H ja J sekä 6C ja D) ajasta riippuvalla tavalla epidermaaliset solulinjat molemmissa mRNA: ssa (viikunat. 5D, E, G ja H sekä 6C ja D) ja proteiini (Kuva. 5J) tasot, joiden ck10-ja CK14-ilmentymän huippupitoisuudet havaitaan 24 tunnin kuluttua 1,5 mMCa2+ – käsittelyn aloittamisesta Heksissä (Figs. 5D, E ja J ja 6C) ja HaCaT-solut (viikunat. 5G, H ja J sekä 6D). Ca2+ – käsittelyn jälkeen CK19: n ilmentymistä alennettiin Heksissä, ja se saavutti alhaisimman tasonsa 24 tunnissa Ca2+ – käsittelyn aloittamisen jälkeen(viikunat. 5F ja J ja 6C). Samanlaisia tuloksia havaittiin theHaCaT-soluissa (viikunat. 5I ja j and6D). ECM-hoito kuitenkin vähensi Ca2+ – antoon liittyneiden keratinosyyttien differentiaatiovasteita HEKs-ja HaCaT-soluissa ja paransi CK19: n ilmentymistä 12 tunnin ja 24 tunnin kuluttua Ca2+ – hoidon jälkeen (kuva. 5F, I ja J). BM: n mahdollisen roolin määrittämiseksi epidermaalisen keratinosyyttikäyttäytymisen säätelyssä tyypin IV kollageenia käytettiin BM: n kaltaisen rakenteen muodostamiseen in vitro. Kollageenikäsittely vaikutti ck19: n ilmentymiseen ja vähensi ck10: n ja CK14: n ekspressiota mRNA: n ja proteiinin tasoilla molemmissa Heksissä(Kuva. 7A – C ja G) ja HaCaTcells (Kuva. 7D-F ja G). Tulokset vahvistivat edelleen in vivo-tuloksiamme, joiden mukaan BMP toimii positiivisena säätelijänä epidermiksen tyvikerroksen prekursorin kaltaisten solujen rekrytoinnissa.Muutokset BM-rakenteessa edistivät aproliferatiivisen fenotyypin kehittymistä basaalikeratinosyyteissä, mikä ilmenee solujen proliferaatioon liittyvien merkkiaineiden, esim.CK14: n ja CK5: n, voimakkaampana ilmentymisenä.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa selvitimme ensin morfologisia muutoksia, joita tapahtuu epidermaalisen regeneraation aikana haavan paranemisprosessin yhteydessä. Tutkimuksemme osoittivat, että hypertrofisten arpikudosten historiallinen rakenne poikkesi normaalin ihokudoksen rakenteesta, ja tyvikerroksen ja marraskeden välinen paksuuskasvu lisääntyi merkittävästi. Erityisesti BM: n värjäytyminen näytti olevan arpikudoksen absentiinia. Lisäksi CK10 -, CK14 -, CK5 -, CK19-ja integriini-β1-solujen immunofluoresenssivärjäys osoitti, että tyvikeratinosyyttien differentiaaliekspressio erosi normaalien, haavan reunan ja hypertrofisten arpikudosten näytteistä ja että hypertrofisen arpikudoksen orvaskeden proliferatiivinen fenotyyppi vaihtoi integriini-β1: n ja CK19: n ilmentymisen CK14-ja CK5-solujen proliferaation merkkiaineisiin monikerroksisessa orvaskedessä. Kun otetaan huomioon nämä havainnot, olemme näin oletettu, että BM: llä on rooli säätelyssäkellon kohtalonpäätös epidermaalisten keratinosyyttien haavan aikana healing.By BM: n komponentteihin liittyvien vasta-aineiden paneelin avulla arvioimme hypoteesimme, että BM: n rakenne oli muuttunut hypertrofisissa arpikudoksissa. Tuloksemme osoittivat, että Bmcovasti ck19-ilmentävien solujen rekrytointiin normaalin ja haavan reunan orvaskeden pohjakerroksessa, jossa BM: n rakenteessa olevat normaalit poikkeavuudet indusoivat basalkeratinosyytit erottamaan ja hyväksymään proliferatiivisen fenotyypin arpipatogeneesin aikana. Käyttämällä ECM: ää ja kollageeni IV: tä jäljittelemään BM: n rakennetta in vitro, vahvistimme invivo-havaintojamme ja osoitimme, että BM vähensi keratinosyyttien erilaistuvia vasteita, jotka indusoituivat cca2+: n antamisesta epidermaalisissa solulinjoissa, ja paransi ck19: n ilmentymistä, joka on oletettu epidermalprogenitorisolujen merkkiaine.

BM: llä on keskeinen rooli solujen erilaistumisessa, proliferaatiossa, eloonjäämisessä ja migraatiossa alkionkehityksen aikana. Ihossa, BM fyysisestiparates orvaskeden päässä dermis. Orvaskeden basalkeratinosyytit kiinnittyvät taustalla olevaan BM: ään integriinien kautta, jotka sitoutuvat joihinkin BM: n komponentteihin, kuten kollageeniin,laminiiniin ja fibronektiiniin (25).Näin ollen BM ei toimi vain selektiivisenä esteenä ja rakenteellinenkannustimena, vaan se tarjoaa myös kommunikaatiorajapinnanermaalisten fibroblastien ja epidermaalisten keratinosyyttien (2,26) välillä.BM sitoutuu myös useisiin sytokiineihin ja kasvutekijöihin ja toimii niiden hallitun vapautumisen varastona,mikä säätelee keratinosyyttien ja fibroblastien yhteisvaikutuksia ihon kehityksen sekä haavan paranemisen edistämiseksi (27,28). Aiemmat arpimuodostusta koskevat tutkimukset ovat keskittyneet pääasiassa fibroblasteihin, ja epidermaalisten keratinosyyttien (29,30) yläpuolisesta osasta tiedetään vain vähän. On kasvavaa näyttöä siitä, ettäkeratinosyyteillä voi olla tärkeä rooli patologisen fibroosin kehittymisessä fibroblastifunktion parakriinisäätelyn kautta (6,9,10).on myös osoitettu, että arpikudoksista johdetut keratinosyytit erosivat normaaleista keratinosyyteistä näyttämällä differentiaaligeneekspressioprofiileja (12). Themechanisms vastuussa perustavanlaatuisia poikkeavuuksia inkeratinosyyttien aikana keloid ja hypertrofinen arpeutuminen ovat edelleen vaikeasti. Tietojemme mukaan BM: n remodeling ja keratinosyyttien toiminnan ylläpitäminen haavan korjaamisen ja uudistamisen aikana voivat olla yhteydessä toisiinsa. On hyvin tunnettua, että adheesiomolekyylit, kuten integriinit ja E – ja N-cadheriini, ankkuroivat kantasolut ECM: ään(22). Näiden havaintojen valossa näyttää siltä, että BM voi olla osa ihon orvaskeden tyvikerroksessa olevien epidermaalisten kantasolujen rekrytointiin tarkoitetuista komponenteista. Tuloksemme osoittavat, että BM: n epänormaali toiminta vähentää basalprogenitor-solujen kiinnittymistä ympäröivään mikroympäristöön ja saa ne omaksumaan proliferatiivisen fenotyypin, mikä voi selittää arpeutumisen (Kuva.8).

kiitokset

tätä tutkimusta tuettiin osittain Pekingin Ohjelman (nro 2008b53 ja 2009a38) ja Kiinan kansallisen Natural Science Foundationin (nro 30901564,81101883, 81372067, 81121004 ja 81230041) sekä kansallisen perustieteen ja kehityksen apurahoilla. ohjelma (973 ohjelma, 2012cb518105).

	Fuchs E ja Raghavan S: Getting under theskin of epidermal morphogenesis. Nat Rev Genet. 3:199–209. 2002.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Breitkreutz D, Mirancea n ja Nischt R: Kellarikalvot iholla: ainutlaatuiset matriisirakenteet monipuolisilla toiminnoilla? Histochem Cell Biol. 132:1–10. 2009. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Blanpain C ja Fuchs E: Epidermal stemcells of the skin. Annu Rev Cell Dev Biol. 22:339–373. 2006.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Snippert HJ, Haegebarth A, Kasper M, JaksV, van Es JH, Barker N, van de Wetering M, van den Born M, BegthelH, Vries RG, et al: Lgr6 merkitsee karvatupen kantasoluja, jotka muodostavat kaikki ihon solulinjat. Tiede. 327:1385–1389.2010. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Broughton G II, Janis JE ja Attinger CE: haavan paranemisen perustiede. Plast Reconstr Surg. 117 (Suppl7): 12S-34S. 2006. Katso Artikkeli: Google Scholar : PubMed/NCBI
	Bellemare J, Roberge CJ,Bergeron D, Lopez-Vallé CA, Roy M ja Moulin VJ: Epidermis edistää ihokudosta: rooli hypertrofisten arpien patogeneesissä. J Pathol.206:1–8. 2005. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Andriessen MP, Niessen FB, Van de KerkhofPC ja Schalkwijk J: hypertrofinen arpeutuminen liittyy epidermaalisiin poikkeavuuksiin: immunohistokemiallinen tutkimus. J Pathol.186:192–200. 1998. Näytä Artikkeli : Google Scholar
	Teepe RG, Kreis RW,Koebrugge EJ, Kempenaar JA, Vloemans af, Hermans RP, Boxma H, Dokter J, HermansJ, Ponec M, et al: viljellyn autologisen epidermiksen käyttö laajojen palovammojen hoidossa. J Trauma. 30:269–275. 1990.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Funayama E, Chodon T, Oyama A ja SugiharaT: keratinosyytit edistävät proliferaatiota ja estävät apoptoosin underlying fibroblasts: tärkeä rooli patogeneesi ofkeloid. J Invest Dermatol. 121:1326–1331. 2003. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Lim IJ, Phan TT, Bay BH, Qi R, Huynh H,Tan WT, Lee ST ja Longaker MT: Keloidkeratinosyyteillä kuorrutetut fibroblastit: normaalit fibroblastit erittävät kollageenia keloidlikemannerissa. Am J Physiol Cell Physiol. 283: C212-C222. 2002. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Hahn JM, Glaser K, McFarland KL, AronowBJ, Boyce ST ja Supp DM: Keloidijohdannaisilla keratinosyyteillä on anabnormaali geenin ekspressioprofiili, joka sopii keloidipatologiassa erilliseen syyrooliin. Haavan Korjaus Regen. 21:530–544. 2013.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Machesney M, Tidman N, Waseem A, Kirby Land Leigh I: aktivoidut keratinosyytit hypertrofisten arpien orvaskedessä. Olen J Pathol. 152:1133–1141. 1998.PubMed/NCBI
	Orazizadeh M, Hashemitabar M, BahramzadehS, Dehbashi FN ja Saremy S: Entsymaattisten ja kasvisten menetelmien vertailu ihmisen esinahasta eristettyjen keratinosyyttien viljelyyn. Biomed Rep. 3: 304-308. 2015.PubMed/NCBI
	Su L, Morgan PR ja Lane EB: Keratin 14ja 19 ilmaisun normaali, dysplastinen ja pahanlaatuinen oralepithelia. In situ-hybridisaatiota jaimmunohistokemiaa hyödyntävä tutkimus. J Oral Pathol Med. 25:293–301. 1996.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Michel M, Török N, Godbout MJ, Lussier M, Gaudreau P, Royal A ja Germain L: Keratin 19 biokemikaalimerkkinä ihon kantasolujen in vivo ja in vitro: keratin 19expressing solut ovat eri lokalisoitu funktio ofanatomic sivustoja, ja niiden määrä vaihtelee luovuttajan ikä ja kulttuurivaihe. J Cell Sci. 109:1017–1028. 1996.PubMed/NCBI
	Khanom R, Sakamoto K, Pal SK,Shimada Y, Morita K, Omura K, Miki Y ja Yamaguchi a: Tyvisolusellokeratin 15: n ja keratiini 19: n ilmentyminen suun okasolukasvaimissa edustaa käänteistä patofysiologiaa. Histoli Histopatoli. 27:949–959.2012.PubMed/NCBI
	Fuchs E: Skin stem cells: rising to thesurface. J-Solu Biol. 180:273–284. 2008. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Yeh YC, Lin HH and Tang MJ: a tale of twocollagen receptors, integrin β1 and discidin domain receptor 1, inepithelial cell differentation. Am J Physiol Cell Physiol.303: C1207–C1217. 2012. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Borowska K, Jedrych B, Czerny k andZabielski S: Integriinien rooli fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa. Pol Merkur Lekarski. 21:362–366. 2006.Articlein Polish.
	Lane SW, Williams DA ja Watt FM: modulating the stem cell markkinarako for tissue regeneration. Natbioteknol. 32:795–803. 2014. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Breitkreutz D, Koxholt I, Thiemann k andNischt R: Skin basement membrane: the foundation of epidermalintegrity – BM functions and different role of bridging moleculesnidogen and perlecan. Biomed Res Int. 2013(179784)2013. Katso artikkeli: Google Scholar
	Timpl R ja Brown JC: kellarin kalvojen supramolecular Assembly. Bioanalyysit. 18:123–132. 1996.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Hennings H, Michael D, Cheng C, SteinertP, Holbrook K ja Yuspa SH: Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture. Solu.19:245–254. 1980. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Hennings H ja Holbrook KA: Solujen ja solujen välisen kontaktin calciumsäätely ja epidermalsellien erilaistuminen viljelmässä. Ultrarakenteellinen tutkimus. Exp Cell Res. 143: 127-142. 1983. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Burgeson RE and Christiano AM: Thedermal-epidermal junction. Curr Opinin Solubiol. 9:651–658. 1997.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	LeBleu VS, Macdonald B ja Kalluri R: Kellarikalvojen rakenne ja toiminta. Exp Biol Med (Maywood). 232:1121–1129. 2007. Näytä Artikkeli : Google Scholar
	Iozzo RV: kellarin kalvo proteoglykaanit: kellarista kattoon. Nat Rev Mol Cell Biol. 6:646–656. 2005.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Werner s, Krieg T ja Smola H: Keratinocyte-fibroblast interaktiot haavan paranemisessa. J InvestDermatol. 127:998–1008. 2007. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Moulin V, Castilloux G, Auger FA, GarrelD, O ’ Connor-McCourt M ja Germain L: Moduloitu vaste ihmisen haavan parantavien myofibroblastien sytokiineille verrattuna ihofibroblasteihin. Exp Cell Res. 238: 283-293. 1998. Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI
	Gabbiani G, Ryan GB ja Majne g: modifioitujen fibroblastien Presenceof modified fibroblasts in granulation tissue and their possiblerole in wound contraction. Experientia. 27:549–550. 1971.Katso artikkeli: Google Scholar: PubMed/NCBI