International Journal of Molecular Medicine

Introduction

皮膚は、中胚葉起源の基礎真皮と外胚葉起源の無オーバーレイ表皮を構成する内部体と外部環境との間の物理的および化学的障壁として機能する。 これらのtwolayersは異なる機能を実行しますが、さまざまな方法と異なるレベルで通信します。 皮膚の重要なバリア機能は、主に基底および分化した基底上ケラチノサイト（1）で構成されるその上部層状表皮によって提供される。 これらの機能を完了するために、基底層の幹細胞は生涯を通じて自己再生することができ、それらは分化を受ける娘細胞を産生する（2）。 したがって、基底ケラチノサイトの増殖と分化とのバランスは表皮の完全性に不可欠であり、正常な生理学的機能を完了するために必要な組織の更新の発生を保証する。 組織の恒常性を維持することに加えて、表皮および毛包に存在する幹細胞は、損傷後の表皮の修復にも関与する（3,4）。 ケラチノサイトは、外部環境に対する身体の”最初の行”を表す。 したがって、彼らは怪我に対する最初の応答者です。 炎症性サイトカインの放出および膠原線維の収縮により、基底表皮ケラチノサイトが活性化され、創傷領域に移動し、組織の細胞含量が更新されるまで増殖して分化する（5）。 多くの観察があります表皮が皮膚瘢痕の病理に影響を及ぼすことが示唆されている（6,7）。 火傷患者では、創傷が二次的意図によって治癒すると肥大性瘢痕がより頻繁に発生するが、早期の皮膚移植は瘢痕形成を抑制するように見える（8）。 船山らは、ケロイド由来ケラチノサイトと共培養したケロイド由来線維芽細胞は、正常皮膚由来ケラチノサイトと共培養したものよりも有意に増殖性およびアポトーシスに耐性であることを示した（9）。 特に、ケロイド由来の角質細胞は、正常細胞における発現レベルと比較してDNA複製に不可欠なヒストン遺伝子のセットの発現の増加を示すことが示されており、肥厚性瘢痕の表皮の角質細胞は、代替分化経路に入り、増殖性フェノタイプを発現している（11,12）。 これらの結果から，ケラチノサイトの増殖と分化とのバランスははん痕組織において調節不全であり，ケラチノサイトの基本的異常は以前に評価されていたよりも皮膚再生とその病因において重要な役割を果たすことが示唆された。

本研究では、正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織を得、形態学的および免疫蛍光法を用いて分析し、形態学的および表皮再生におけるケラチン発現プロフ 正常，創傷縁および肥厚性はん痕組織からの表皮角化細胞におけるケラチン発現プロファイルに変化があり，基底膜（Ｂ ｍ）の構造の異常に対応していることが示唆された。 BMcomponentsへの抗体のパネルを使用して、我々は我々の仮説を検証し、BMwas前駆体様細胞表皮の基底層の募集の正のレギュレータであることを決定しました。 我々のデータは、BMの構造におけるalterationsは、in vivoとinvitroの両方で増殖表現型を採用する基底ケラチノサイトステストを促進することを示しています。

材料および方法

組織サンプル

肥大性瘢痕組織（女性4人および男性3人、年齢範囲18-40歳）および創傷縁組織（女性3人および男性5人、年齢範囲、18-40歳）のサンプルは、以前の再建熱傷手術を受けた患者から得られた。 手術中のscarexcisionに隣接する正常な皮膚組織（4femalesおよび3男性;年齢範囲、18-40歳）を対照として使用した。 包皮も割礼を受けている男性（10人の男性、年齢範囲、18-20歳）から採取された。 本研究は、中国人民解放軍総合病院（北京、中国）の倫理委員会によって承認され、サンプルを得る前にすべての個人からインフォームドコンセントを得た。

免疫蛍光染色

正常な皮膚、創傷縁および肥厚性瘢痕組織サンプルを10％緩衝ホルマリンに固定し、濃度を増加させたエタノール溶液を連続的に脱水し、最終的にパラフィンに埋め込まれた。 パラフィン埋め込み組織を、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＜７ ０ ３ ９＞Ｅ）、Ｍａｓｓｏｎのｔｒｉｃｈｒｏｍｅおよびｍｅｔｈｅｎａｍｉｎｅ ｓｉｌｖｅｒ（全て、中国の北京市中山金橋から）で染色するために、４μ ｍ厚の切 光学顕微鏡（Ｂ Ｘ５ ３；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて画像を撮影した。 ２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ０ ０（Ｔ８ ７ ８ ７；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）中で、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で１ ０分間機械化した。 Thesectionsは室温の4°Cのovernightandの第一次抗体との2時間のための二次抗体との第一次反ボディと孵化しました。 以下の一次抗体を使用した：マウス抗ヒトトケラチン（ＣＫ）１ ０（１：２ ０ ０、ａｂ１ １ １ ４ ４ ７）およびウサギ抗ヒトＣＫ１ ４（１：２ ０ ０、ａｂ７ ８ ０ ０）（両方とも、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍ Ａ，ＵＳＡから）、ウサギ抗ヒトＣＫ５（１：２ ０ ０、Ｚ Ａ−０ ５ １ ８；Ｊｏｈｎｓｈａｎｇｈ Ｇｏｌｄｅｎｂｒｉｄｇｅ，Ｂｅｉｋｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）、マウａｂ５ ３ １ １ ９；ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ヒトインテグリン−Β１（１：２ ０ ０，ＰＢ０ ０ ６ ３；Ｂｏｓｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ，ｃｈｉｎａ）；マウス抗ヒトインテグリン−β４（１：２ ０ ０，Ａｂ１ ２ ８ ０ ６ ８；Ａｂｃａｍ）、マウス抗ヒトラミニン（１：２ ０ ０，ＰＢ０ ０ ６ ３；ｂｏｓｔｅｒ，Ｗｕｈａｎ，ｃｈｉｎａ）；マウス抗ヒト:びマウス抗ヒトコラーゲンＩＶ（１：２ ０ ０、ＺＭ−０ ０ ８ １；Ｊｏｈｎｓｈａｎｇｈ Ｇｏｌｄｅｎｂｒｉｄｇｅ）を含む。 以下の二次抗体を使用した：Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ４ ８ ８結合抗マウス（１：２ ０ ０、ａｂ１ ５ ０ １ １ ７）およびＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５ ９ ４結合抗ウサギ（１：２ ０ ０、ａｂ１ ５ ０ ０ ８ ０）（両方ともＡｂｃａｍから）。 核をＤＡＰＩ（Ｈ−１ ２ ０ ０；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）で染色した。共焦点レーザー走査顕微鏡（ＳＰ８；Ｌｅｉｃａ，Ｓｏｌｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して免疫蛍光画像を撮影した。

細胞培養と治療

一次ヒト表皮ケラチノサイト（HEKs）は、以前に記載されているように男性の包皮から分離されました（13）、マイナーな変更を加えました。 ヒト免疫化ケラチノサイト（Ｈａｃａｔ）細胞は、Ｃｈｉｎａ Ｉｎｆｒａｓｔｒｕｔｕｒｅ ｏ ｆ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ（３ １ １ １Ｃ０ ０ ０ １ＣＣＣ０ ０ ０ ３ ７ ３；Ｂｅｉｋｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）から購入した。 ０ ６ｍ ＭのＣａ２＋、１％Ｅｐｉｌｉｆｅ定義増殖補助剤（Ｓ−０ ０ １−５）を補充したＥｐｉｌｉｆｅ培地（Ｍ−ＥＰＩ−５ ０ ０−Ｃ Ａ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）中で、ＨｅｋｓおよびＨａｃａｔ細胞の両方をインキュベートした。; Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ１ ４ ０ ０；Ｓｏｌａｒｂｉｏ，Ｂｅｉｋｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）。 In vitroでのケラチノサイトの挙動を調節するBMの役割を調べるために、HEKsとHaCaT細胞は、それぞれMaxGel ECM（E0282）とcollagen IV型（C7521）（両方ともSigma-Aldrichから）でコーティングされた60mm-ディCa2+処理のために、細胞を1.5mM Ca2+を補充したEpiLifemedium中で0、12および24時間インキュベートした。MaxGel ECMはいくつかのproteoglycansおよびglycosaminoglycansとしてcollagens、ラミニン、フィブロネクチン、tenascinおよびエラスチンを含む人間の細胞外のマトリックス（ECM）のcomponentsincludingを、aswell含んでいます。 Ca2+で処理されたcellsnotを対照として使用した。＜9429＞＜709＞逆転写定量（リアルタイム）PCR（RT-qPCR）＜1806＞＜2904＞TRIzol reagent（15596-026；Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）を用いて各種処理を行った後、細胞から総RNAを単離し、GoScript reverse transcriptase（A5001）を用いてcDNAを合成した。; Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を製造業者の説明書に従った。 ＱＰＣＲ反応は、Ａｂｉ７ ５ ０ ０Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍおよびソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）を使用して、Ｇｏｔａｑ ＱＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａ６ ０ ０ １；Ｐｒｏｍｅｇａ）と共に実施した。 反応プロトコルは、95℃で15秒、55℃で30秒、および72℃で30秒で40サイクルのPCR増幅から成っていた。

ウェスタンブロット分析

細胞から総タンパク質を単離し、20μ gのタンパク質を基質可溶性緩衝液に溶解した。 次いで、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ontopolyvinylidene difluoride（ＰＶＤＦ）膜（ＩＰＦＬ０ ０ ０ １ ０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍ Ａ，ＵＳＡ）に移した。 フォウェスタンブロット分析で使用された抗体は、ＣＫ１ ０（１：１ ０ ０ ０、ａｂ１ １ １ ４ ４ ７）、ＣＫ１ ４（１：５ ０ ０、ａｂ７ ８ ０ ０）、ＣＫ１ ９（１：５ ０ ０、ａｂ５ ３ １ １ ９）、インテグリン−β４（１：１ ０ ０ ０、ａｂ１ １ １ ４ ４ ７）、ｃｋ１ ０（１：１ ０ ０ ０、ａｂ１ １ １ ４ ４ ７）、ｃｋ１ ４（１：５ ０ ０、ａｂ７ ８ ０ ０）、ｃｋ１ ９（１：５ ０ ０、ａｂ５ ３ １ １ ９）、:マウス抗ヒトβ−アクチン抗体（１：５ ０ ０ ０、ａｂ６ ２ ７ ６）（全てＡｂｃａｍ社製）。 洗浄後、膜を二次抗体でインキュベートし、これはヤギ抗ウサギおよびヤギ抗マウスＩｇｇをワサビペルオキシダーゼに結合させた（ｓｃ−２ ０ ０ ４，１：１ ０ ０ ０；ｓｃ−２ ０ ０ ５，１：１ ０ ０ ０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，Ｃ Ａ，ＵＳＡ）。 免疫反応性バンドを、ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ（ＥＣＬ）キット（ＰＥ−０ ０ １ ０−１ ０ ０；Ｓｏｌａｒｂｉｏ、Ｂｅｉｊｉｎｇ、Ｃｈｉｎａ）によって検出し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔ ＬＡＳ４ ０ ０ ０システム（ＧＥ Ｈ Ｅａｌｔｈｃａｒｅｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＵＳＡ）を使用して撮像した。

統計分析

特に断りのない限り、すべての実験を少なくとも3回繰り返した。 データは、平均±標準偏差（Ｓ Ｄ）として提示される。 統計分析は、ＳＰＳＳ２ ０． データ比較は、独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定および一方向Ａ ＮＯＶＡに続いてＬｓｄｔｅｓｔを用いて行った。 P値<0.05は、統計的に有意な差を示すと考えられた。

結果

正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織における形態学的差異

皮膚創傷修復は正確なリモデリングプロセスであり、古典的に四つの重複期に分けられ、多くの異なる組織および細胞の相互作用を伴う(5)。 しかし、慢性創傷では、正常な治癒過程が中断され、炎症およびプロテアーゼ放出の病理学的サイクルにおいて、病理学的瘢痕の発症に至る。 本研究では、皮膚創傷治癒中にregeneratingepidermisに発生する形態学的変化を評価するために、正常、woundedgeおよび肥大瘢痕組織の標本は、順序toperformルーチンH&Eおよびマッソンのトリクローム染色で得られた。 通常の皮膚サンプルでは、皮膚の組織学的構造は、表皮および真皮の層を示し、可視であった。 表皮は4-5層を含み、ケラチノサイトは外側通過中に棘細胞、顆粒細胞および角化細胞に分化し、徐々に成熟した（Fig. 1A）。 さらに、下胚葉では、線維芽細胞が緩んだ結合組織を構成しており、これは平行コラーゲン線維であった（図2）。1D）。 しかし、創傷縁の周りの組織では、表皮は増殖し、異なる形態の角質細胞の複数の層で構成され、目に見えて増加した厚さであった（図）。 およびＥ）。 表皮と真皮は指のような突起（rete ridgesと呼ばれる）を介して連動し、表皮と真皮の間の接触面積を増加させた。 正常組織と創傷組織の両方で、基底ケラチノサイトは、上記の棘細胞層に接続された立方体または低柱状細胞の連隊の単一層として配置された（Fig.およびＢ）。 肥厚性瘢痕組織の組織学的構造は、豊富な血液供給および厚い表皮層を有することによって、正常な皮膚組織の組織学的構造とは異なっていた（図 １ｃおよびＦ）。 真皮は、不規則な形状の膠原線維およびより大きな直径を含む、高密度で無秩序な結合組織で構成されていた（図10）。 1階）。 正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織間の組織学的構造の違いをさらに明確にするために、メテナミン銀染色を行い、BMの形成を評価し、bm構造が正常および創傷縁組織の切片で検出可能であることを示した（図）。 1GおよびH）。 しかし、瘢痕組織では、ＢＭ染色は存在しなかった（図１ ０Ｂ）。1I）。

正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織における表皮ケラチノサイトにおけるセルマーカーの発現の違い

正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織に観察された形態学的差異を考慮して、基底ケラチノサイトが瘢痕形成中に異なる細胞挙動を示すかどうかを調べた。 最初に、我々は、正常、創傷縁および瘢痕組織の切片におけるCK10、CK14、CK5、CK19およびインテグリン-β1の発現を検出するために免疫蛍光染色を行った。 これまでの研究では、ck10は分化したケラチノサイトのマーカーであり、CK14とCK5は基底ケラチノサイトまたはTAsのマーカーであり、CK19は皮膚の表皮前駆細胞または幹細胞のaputativeマーカーであることが確認されている（14-17）。 インテグリン-β1はまた、皮膚の前駆細胞のamarkerであると考えられている（18,19）。 我々の結果は、CK10が正常および創傷縁組織における表皮の外層で発現されたことを示した（図。 は、肥厚性瘢痕組織の表皮において最終的に分化する細胞（図２ＡおよびＢ）、および基底上において、肥厚性瘢痕組織の表皮において最終的に分化する細胞（図２ＡおよびＢ）を含む。 2C）。 ＣＫ１ ４は、全ての３つの組織の層状表皮における基底層および基底上層の両方で発現された（図１ ０Ａ）。 瘢痕組織の多層表皮には、ＣＫ１ ４の広範な分布があった（図２Ｄ−Ｆ）。2階）。 CK5の分布パターンはck14と同様であった（図。 2G–I）は、hyperproliferative表皮の増殖の細胞の増加した数をindicatedan。 インテグリン-β1およびCK19は、正常表皮の基底層に発現した（図。 創傷縁表皮の基底層および基底層（図2JおよびM）および創傷縁表皮の基底層および基底層（図2JおよびM）および創傷縁表皮の基底層（図2JおよびM） 図2KおよびN）では検出できなかったが、肥厚性瘢痕組織の表皮では検出できなかった（図2KおよびN）。 2LおよびO）。 総称して、これらの観察は、玄武角化細胞のケラチン発現プロファイルが正常、創傷縁および肥厚性瘢痕組織の間で異なっていたことを示している。 より少ないＣＫ１ ９発現細胞は、肥大性瘢痕組織の基底層および基底上層で検出されたが（図１ ０Ａ）、ｃｋ１ ９発現細胞は、ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ ｓｃａｒｇｅ組織の基底層および基底上層で検出され2P）、増殖表現型は、多層表皮におけるCK14およびCK5の発現の増加のために明らかにされた。

変化したBM構造は、表皮ケラチノサイトインビボにおける分化ケラチン発現プロファイルに寄与する

幹細胞ニッチの重要な構成要素として、Ecmnは幹細胞をアンカーするだけでなく、その運命を指示する（20）。 上記のように、BMの歴史的構造は、肥大性瘢痕組織サンプルには存在しないように見えた。 正常，創傷端および肥厚性はん痕表皮の基底層におけるケラチン発現プロファイルの違いを考えると，ＢＭの構造異常は創傷治癒中の基底ケラチノサイトの細胞運命決定を調節する役割を果たすと推測した。 この仮説を検討するために、免疫蛍光染色を実施し、正常、創傷縁および肥大性瘢痕組織試料中のＢＭの成分を可視化した。 本発明者らの結果は、両方の正常のBM領域でcollagen IV発現が検出されたことを明らかにした（図10）。 および創傷縁部（図３Ａ）および創傷縁部（図３Ａ）。 3B）組織。 しかし、肥厚性瘢痕組織の表皮には、コラーゲンIv発現の不在を伴うBM様構造の形成が観察された（図。 3C）。 ラミニンの発現は三つの組織タイプすべてで検出されたが（図。 図３Ｄ−Ｆ）、ラミニン−５およびその受容体インテグリン−β４の二重標識により、ｂｍの構造が肥大性瘢痕組織の表皮において変化したこと；ラミニン−５およ図3Iおよび4G–I）は、通常のものと比較して観察された（図3Iおよび4G-I）。 および４Ａ−Ｃ）および創傷縁組織（図３Ｇおよび４Ａ−Ｃ）。 ３Ｈおよび４Ｄ−Ｆ）。 これらの知見を考えると、正常なBMは、正常な縁の表皮の基底層におけるインテグリン-β1-およびCK19発現細胞の動員に寄与したと考えられる。 しかし，ｂｍ構造の異常は，はん痕病因の間に基底ケラチノサイトを分化させ，増殖性表現型を採用するよう誘導した。

変更されたBM構造は、in vitroで増殖表現型を採用する表皮角化細胞を促進する

BMによって提供される機械的支持体は、主にIV型コラーゲン足場（21）によっ 表皮ケラチノサイトの挙動の調節におけるtheBMの役割をさらに明らかにするために、我々は細胞-マトリックス接着のパターンを制御するために培養皿をコートするために、ヒトBM抽出物由来のECMを使用した。 図に示すように。 図5に示すように、HEKSにおけるインテグリン-β4発現のアップレギュレーションにおいてECM投与が行われた（図。 およびＨａｃａｔ（図５Ａ）を参照されたい。 5B)細胞は、血漿膜上および細胞-マトリックス付着の部位に存在していた。 我々はまた、ECMcoatingの有無にかかわらず、表皮細胞株におけるインテグリン-β4のタンパク質レベルを調べるためにウェスタンブロット分析を実行しました。 本発明者らのデータは、対照群よりもＥＣＭ処理群で高レベルのインテグリン−γ４が検出可能であることを実証し、蛍光免疫染色所見をさらに確認した（図 5C）。 さらに、ＨｅｋｓおよびＨＡＣＡＴ細胞を、以前に記載されたように、表皮細胞を分化させるために示された期間の間、１.５ｍＭＣＡ２＋を含有する培地に切り替えた（２ ３、２ ４）。 Ｃａ２＋処理に続いて、両方のＨｅｋにおける形態学的変化（図１ ０Ａ）。 およびＨａｃａｔ細胞（図６Ａ）およびＨａｃａｔ細胞（図６Ｂ）。 Ｃａ２＋は、ＣＫ１ ０の発現を誘導した（図６Ｂ）（ｃａ２＋は、ｃｋ１ ０の発現を誘導した（図６Ｂ））。 およびＤ）およびＣＫ１ ４（図５Ｄ、ＧおよびＪ、および６ＣおよびＤ）およびＣＫ１ ４（図５Ｄ、ＧおよびＪ、および６ＣおよびＤ）。 （図５Ｅ、ＨおよびＪ、および６ＣおよびＤ）の両方のｍｒｎａにおける表皮細胞株の時間依存的に（図５Ｅ、ＨおよびＪ、および６ＣおよびＤ）の両方のｍｒｎａにおける表皮 5D用、E、G、H、6C D)ならびにタンパク質。 ５ｍｍＣａ２＋処理を開始した後２ ４時間後に観察されるＣｋ１ ０およびＣＫ１ ４発現のピークレベル（図５Ｊ）のレベルで観察される（図５Ｊ）。 およびＪおよび６Ｃ）およびＨａｃａｔ細胞（図５Ｄ、ＥおよびＪおよび６Ｃ）を含む。 ５Ｇ、ＨおよびＪおよび６Ｄ）。 Ｃａ２＋処理後、Ｃｋ１ ９の発現は、Ｈｅｋｓにおいて下方制御され、Ｃａ２＋処理の開始後２ ４時間で最も低いレベルに達した（図３、４、５、６、７、８、９、１ ０、１ １、１ ２、１ ３、１ ４、１ ５、１ ６、１ ７、１ ８、 ５ＦおよびＪおよび６Ｃ）。 同様の結果が、ＨＡＣＡＴ細胞において観察された（図１ ５Ａ）。 ５ＩおよびＪおよび６Ｄ）。 しかし、ＥＣＭ処理は、ＨｅｋｓおよびＨａｃａｔ細胞におけるＣａ２＋投与に関連するケラチノサイトの分化応答を減少させ、Ｃａ２＋処理後の１ ２時間および２ ４時間でＣＫ１ ９の 5F,Iand J)。 さらに、表皮ケラチノサイトの挙動の調節におけるBMの潜在的な役割を決定するために、IV型コラーゲンは、in vitroでBM様構造を形成するために使用され コラーゲンＩｖ治療は、Ｃｋ１ ９発現に寄与し、両方のＨｅｋにおけるｍＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＣＫ１ ０およびＣＫ１ ４の発現を減少させた（図１）。 およびＧ）およびＨａｃａｔｃｅｌｌｓ（図７Ａ〜ＣおよびＧ）を含む。 およびＧ）。 これらの結果は、さらにBMappears表皮の基底層における再発様細胞の募集の正のレギュレータであることを我々のin vivoでの知見を検証しました。BM構造の変化は、細胞増殖、例えば、CK14とCK5に関連付けられているマーカーのtheenhanced発現によって示されるように基底ケラチノサイトにおけるaproliferative表現型の開発

本研究では、創傷治癒過程の表皮再生アスパルト中に起こる形態学的変化を最初に調査した。 肥厚性はん痕組織の歴史的構造は正常皮膚組織のそれとは異なり，基底層と角質層の間の表皮厚さの有意な増加が観察された。 特に，ｂｍの染色ははん痕組織に欠失しているようであった。 また、ck10、CK14、CK5、ck19およびインテグリン-β1の免疫蛍光染色は、基底ケラチノサイトマーカーの分化発現が正常、創傷縁および肥大瘢痕組織のサンプル間で異な これらの知見を考えると、我々はこのようにBMは、創傷中の表皮ケラチノサイトの細胞運命の決定を調節する役割を果たしていることを仮定したhealing.By ＢＭ成分に関連する抗体のパネルを用いて，ｂｍの構造が肥大性はん痕組織に変化したという仮説を検証した。 我々の結果は、Bmの構造のwhereasabnormalitiesが分化し、増殖表現型を採用するために基底角化細胞を誘導し、正常および創傷エッジ表皮の基底層におけるCk19発現細胞の募集 ECMとコラーゲンIVを使用してin vitroでtheBM構造を模倣することにより、我々はさらに我々のinvivo観察を確認し、bmは表皮細胞株におけるbyca2+投与を誘導ケラチノサイトのthedifferentiating応答を減少させ、ck19、epidermalprogenitor細胞の推定マーカーの発現を強化したことを示した。

BMは、胚発生中の細胞の分化、増殖、生存および移動において基本的な役割を果たす。 皮膚では、BMは物理的に表皮を基礎となる真皮から分離する。 表皮の基底角化細胞は、コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチン（25）などのいくつかのBM成分に結合する基礎となるBM throughintegrinsに接続します。従って、BMは選択的障壁およびstructuralscaffoldとしてだけでなく、役立ちますが、またbetweenendermal繊維芽細胞および表皮のkeratinocytes（2,26）の通信用インタフェースを提供します。BMはまた、皮膚の開発だけでなく、創傷治癒を促進するためにケラチノサイト-線維芽細胞相互作用をwhichregulates、その制御放出のためのリザーバとして機能し、サイトカインや成長因子の数に結合します（27,28）。 瘢痕形成に関する以前の研究は、主に線維芽細胞に焦点を当てており、上にある表皮ケラチノサイト（29,30）のtheroleについてはほとんど知られていない。 また、瘢痕組織由来のケラチノサイトは、異なる遺伝子発現プロファイルを示すことによって、正常なケラチノサイトとは異なることが示されている(12)。 ケロイドおよび肥大性瘢痕の間のケラチノサイトの基本的な異常の原因となるメカニズムは依然として残っている。 我々のデータは、bmの改造と創傷修復と再生中のケラチノサイト機能の維持との間の潜在的なリンクを示した。 E-カドヘリンやN-カドヘリンなどの接着分子が幹細胞をECMに固定することはよく知られている（22）。 Ourobservationsに照らして、BMは皮の表皮の基底の層の表皮の前駆細胞の募集のためのthenicheの部品の部分を表すかもしれないようです。 我々の結果は、BMの異常な機能は、その周囲の微小環境への玄武原性細胞の付着を減少させ、瘢痕化の病因を説明することができる増殖表現型を採用す8).

謝辞

この研究は、北京のtheNovelプログラム（nos.2008B53および2009A38）および中国のtheNational Natural Science Foundation（nos.30901564,81101883,81372067,81121004および81230041）および国家基礎科学および国家基礎科学開発プログラム（973プログラム、2012Cb518105）。

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