International Journal of Molecular Medicine

wprowadzenie

skóra służy jako fizyczna i chemiczna bariera między ciałem wewnętrznym i środowiskiem zewnętrznym, która obejmuje leżącą pod spodem skórę właściwą pochodzenia mezodermalnego i pokrywający się naskórek pochodzenia ektodermalnego. Chociaż te dwie warstwy pełnią różne funkcje, komunikują się w różny sposób i na różnych poziomach. Barierę życiową skóry zapewnia przede wszystkim jej górny warstwowy naskórek, złożony z proliferacyjnych bazalnych i zróżnicowanych keratynocytów nadbasowych(1). Aby wypełnić te funkcje, komórki macierzyste w warstwie podstawowej są zdolne do samoodnawiania się przez całe życie i produkują komórki potomne, które podlegają różnicowaniu (2). Tak więc równowaga między proliferacją a różnicowaniem keratynocytów bazalnych jest niezbędna dla integralności naskórka i zapewnia wystąpienie odnowy, która jest niezbędna do zakończenia prawidłowych funkcji fizjologicznych. Oprócz utrzymania homeostazy tkanek, komórki macierzyste znajdujące się w naskórku i mieszki włosowe również uczestniczą w naprawie naskórka po urazie (3,4).w skórze różne fazy gojenia się ran ewoluują w dynamicznych interakcjach między komórkami naskórka, komórkami skóry i komórkami pochodzącymi z bonemarrow. Keratynocyty stanowią „pierwszą linię obrony” organizmu przed środowiskiem zewnętrznym. W związku z tym są one pierwszą reakcją na obrażenia. Wraz z uwalnianiem cytokin zapalnych i skurczem włókien kolagenowych, podstawowe keratynocyty naskórka są aktywowane i migrują do obszaru rany, gdzie rozmnażają się i różnicują, dopóki zawartość komórek tkanki nie zostanie odnowiona (5). Wiele obserwacji wykazało, że naskórek ma wpływ na patologię blizn skórnych (6,7). U pacjentów z oparzeniami blizny przerostowe pojawiają się częściej, gdy rany goją się przez wtórną intencję,podczas gdy wczesne szczepienie skóry wydaje się tłumić powstawanie blizn(8). Funayama i aldemonstrował, że fibroblasty pochodzące z keloidów hodowane z keratynocytami pochodzącymi z keloidów były znacznie bardziej proliferacyjne i odporne na apoptozę niż te hodowane z normalnymi keratynocytami pochodzącymi z skóry (9).w podobnym systemie hodowli stwierdzono, że keratynocyty pochodzące z keloidów promowały zwiększoną produkcję kolagenu, a także zwiększoną proliferację normalnych fibroblastów (10). W szczególności wykazano, że keratynocyty pochodzące z keloidów wykazują zwiększoną ekspresję zestawu genów histonowych niezbędnych do replikacji DNA nieporównanie z poziomami ekspresji w normalnych komórkach, a keratynocyty w naskórku przerostowych blizn weszły do alternatywnego szlaku różnicowania i wyrażają proliferatywny fenotyp (11,12). Wyniki te sugerują, że równowaga między proliferacją i różnicowaniem keratynocytów jest dysregulowana w tkankach blizn, a fundamentalne nieprawidłowości w keratynocytach mogą odgrywać ważniejszą rolę w regeneracji skóry i jej patogenezie niż wcześniej doceniano.

w niniejszym badaniu uzyskano i przeanalizowano prawidłowe, krawędź rany i blizny hipertroficzne przy użyciu metodhistologicznych i immunofluorescencyjnych w celu zbadania różnic w morfologii, a także profilów ekspresji keratyny podczas regeneracji naskórka. Wyniki badań wykazały, że w obrębie naskórka występowały różnice w profilach ekspresji keratyny w stosunku do prawidłowych krawędzi rany i blizn przerostowych, co odpowiadało nieprawidłowościom w budowie błony podstawnej (BM). Wykorzystując panel przeciwciał przeciwko składnikom BMK, potwierdziliśmy naszą hipotezę i ustaliliśmy, że BMK jest pozytywnym regulatorem rekrutacji komórek prekursoropodobnych do warstwy podstawnej naskórka. Nasze dane wskazują, żealterracje w strukturze BM promują podstawową keratynocytę do przyjęcia proliferacyjnego fenotypu zarówno In vivo, jak i invitro.

materiały i metody

próbki tkanek

przerostowa tkanka bliznowata (4 kobiety i 3 mężczyźni; wiek 18-40 lat) i tkanka krawędziowa rany (3 kobiety i 5 mężczyzn;Przedział wiekowy, 18-40 lat) pobrano próbki od pacjentów, którzy przeszli wcześniejszą rekonstrukcyjną operację oparzenia. Jako kontrolę zastosowano prawidłową tkankę skóry (4 kobiety i 3 samce; Przedział wiekowy, 18-40 lat) przylegającą do scarexcision podczas operacji. Napletki były również pobierane od mężczyzn poddawanych obrzezaniu (10 samców; Przedział wiekowy,18-20 lat). Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet etyczny chińskiego szpitala ogólnego PLA (Pekin, Chiny) i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich osób przed pobraniem próbek.

barwienie Immunofluorescencyjne

normalna skóra, krawędź rany i przerostowe tkanki bliznowaciałe próbki utrwalono w 10% buforowanej formalinie, odwodniono przez roztwory etanolu o zwiększonym stężeniu kolejno i ostatecznie osadzono w parafinie. Osadzone parafiny pocięto na sekcje o grubości 4 µm w celu barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), trichromem Massona i srebrem metenaminowym (wszystkie z Zhongshan Golden Bridge, Pekin,Chiny). Zdjęcia zostały wykonane przy użyciu mikroskopu optycznego (Bx53; Olympus, Tokio, Japonia). Aby przeprowadzić barwienie immunofluorescencyjne, sekcje utrwalano w 4% paraformaldehydu przez 30 minut, a następnie stabilizowano w 0,2% Triton X-100 (T8787; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) w buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (PBS) przez 10 minut. Sekcje inkubowano z pierwotnymi przeciwciałami w temperaturze 4°C przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie z przeciwciałami wtórnymi. Następnie zastosowano podstawowe antybakteryjne ciała: mysz anty-humancytokeratyna (CK)10 (1:200, ab111447) i królik anty-ludzki CK14(1:200, ab7800) (oba z Abcam, Cambridge, MA, USA), królik anty-ludzki CK5 (1:200, ZA-0518; Zhongshan Goldenbridge, Pekin,Chiny), mysz anty-ludzki CK19 (1:200, ab53119; abcam), rabbitanti-ludzka integryna-β1 (1:200, pb0063; Boster, Wuhan, Chiny); MOUSEANTI-ludzka integryna-β4 (1:200, ab128068; ABCAM), mysi anty-humanlaminina (1:200, zm-0181; Zhongshan Goldenbridge), królik anty-humanlaminin-5 (1:200, ab14509; Abcam) i mysz anty-ludzki kolagen IV(1:200, zm-0081; Zhongshan Goldenbridge). Zastosowano następujące przeciwciała wtórne: skoniugowane przeciw myszom Alexa-Fluor 488 (1: 200, ab150117) i skoniugowane przeciw królikom Alexa-Fluor 594 (1: 200, ab150080) (oba z Abcam). Jądra zostały zabarwione DAPI (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).Obrazy immunofluorescencyjne zostały zarejestrowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu laserowego (SP8; Leica, Solms, Niemcy).

hodowla komórkowa i leczenie

pierwotne ludzkie keratynocyty naskórkowe (HEKs) były izolowane z męskich napletek, jak opisano wcześniej (13), z niewielkimi modyfikacjami. Komórki humanimmortalized keratinocyte (HaCaT) zostały zakupione z infrastruktury sieci komórkowej (3111c0001ccc000373; Pekin, Chiny). Zarówno komórki Heksowe, jak i HaCaT inkubowano w pożywce EpiLife (m-EPI-500-CA; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) uzupełnionej 0,06 mM Ca2+, 1% suplementu wzrostu zdefiniowanego przez EpiLife (S-001-5; Invitrogen LifeTechnologies) i 1% penicyliny / streptomycyny (P1400; Solarbio, Pekin, Chiny). Aby zbadać rolę BM w regulowaniu zachowania keratynocytów in vitro, komórki HEKs i HaCaT były Platerowane w 60 mm naczyniach pokrytych MaxGel ECM (E0282) Icollagen typu IV (c7521) (oba z Sigma-Aldrich), odpowiednio.W leczeniu Ca2+ komórki inkubowano w EpiLifemedium uzupełnionym 1,5 mM Ca2+ przez 0, 12 i 24 h.MaxGel ECM zawiera składniki ludzkiej macierzy pozakomórkowej (ECM), w tym kolageny, lamininy, fibronektyny, tenascyny i elastyny, a także szereg proteoglikanów i glikozaminoglikanów. Komórki nieleczone Ca2+ były stosowane jako grupy kontrolne.

odwrotna transkrypcja-ilościowa (w czasie rzeczywistym) PCR (RT-qPCR)

całkowite RNA wyizolowano z komórek po poddaniu ich różnym zabiegom z użyciem odczynnika TRIzol (15596-026; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), a następnie poddano cDNA syntezie przy użyciu odwrotnej transkryptazy GoScript (A5001; Promega, Madison, WI, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Sekwencje primerowe użyte do amplifikacji genów są wymienione w tabeli I. reakcje qPCR przeprowadzono za pomocą GoTaq qPCR Master Mix (A6001; Promega) przy użyciu systemu i oprogramowania ABI 7500REAL-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City,CA, USA). Protokół reakcji składał się z następujących cykli:95°C przez 15 sekund, 55°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund dla 40 cykli amplifikacji PCR.

Analiza Western blot

całkowite białko wyizolowano z komórek i 20 µg białka rozpuszczono w buforze rozpuszczalnym w substracie. Proteiny zostały następnie rozdzielone przez SDS-PAGE i przeniesione na membrany difluorku poliwinylidenu (PVDF) (IPFL00010; Millipore,Billerica, MA, USA). Po zablokowaniu, plamy badano z pierwotnymi przeciwciałami przez noc w temperaturze 4°C. przeciwciała stosowane do analizy blot wewnętrznych obejmowały CK10 (1:1000, ab111447), CK14(1:500, ab7800), CK19 (1:500, ab53119), integrynę-β4 (1: 500, ab53119),:500, ab128068) i mysie przeciwciało przeciwko ludzkiej β-aktynie(1: 5000, ab6276) (wszystkie z Abcam). Po umyciu membrany inkubowano z przeciwciałami wtórnymi, którymi były kozie anty-królicze i kozie anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową (sc-2004,1: 1000; sc-2005, 1: 1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA,USA). Zespoły immunoreaktywne wykryto za pomocą zestawu enhancedchemiluminescence (ECL) (PE-0010-100; Solarbio, Pekin, Chiny)i zobrazowano za pomocą systemu ImageQuant LAS 4000 (GE HealthcareBio-Sciences, Pittsburgh, USA).

analiza statystyczna

wszystkie eksperymenty powtórzono co najmniej 3 razy, chyba że wskazano inaczej. Dane przedstawia się jako średnie ±odchylenie standardowe (SD). Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania SPSS 20.0. Porównanie danych przeprowadzono przy użyciu testu t niezależnego ucznia i jednokierunkowego ANOVA, a następnie testu LSD. Uznano, że wartość P <0, 05 wskazuje statystycznie istotną różnicę.

wyniki

różnice morfologiczne w prawidłowych,krawędziach rany i przerostowych tkankach blizn

naprawa ran skóry jest precyzyjnym procesem przebudowy,który jest podzielony klasycznie na cztery nakładające się fazy i obejmuje interakcje wielu różnych tkanek i linii komórkowych (5). W przewlekłych ranach jednak normalny proces gojenia jest przerywany, co skutkujest w patologicznym cyklu zapalenia i uwalniania proteazy prowadzącej do rozwoju patologicznej blizny. W badaniu tym, w celu oceny zmian morfologicznych zachodzących w regeneracji naskórka podczas gojenia się ran skóry, uzyskano próbki normalnych, uszkodzonych i przerostowych tkanek blizn w kolejności rutynowej H& E i barwienia trichromu Massona. W próbkach naskórka wykazano strukturę histologiczną skóry, ukazując warstwy naskórka i skóry właściwej. Naskórek składał się z 4 do 5 warstw, w których keratynocyty były różnicowane i stopniowo dojrzewały do komórek kolczystych, komórek ziarnistych i komórek rogowych podczas ich zewnętrznego przejścia (Fig. 1a). Ponadto w podłożu fibroblasty tworzyły luźną tkankę łączną, która była bogata w równoległe włókna kolagenowe (Fig.1D). Jednak w tkankach wokół krawędzi rany naskórek namnażał się; składał się z wielu warstw keratynocytów o wyraźnej morfologii i wykazywał wyraźnie zwiększoną chorobę (Fig. 1B i E). Naskórek i skóra właściwa przeplatają się przez palcowe projekcje (zwane grzbietami rete), które zwiększają powierzchnię kontaktu między naskórkiem i skórą właściwą. Zarówno w tkankach prawidłowych, jak i uszkodzonych, podstawowe keratynocyty ułożono jako uporządkowanąjedną warstwę komórek prostopadłościennych lub niskich kolumnowych, które połączyły się z leżącymi powyżej warstwami komórek kolczystych (Fig.1A i B). Struktura histologiczna przerostowej blizny różniła się od struktury normalnej tkanki skóry bogatym dopływem krwi i grubą warstwą naskórka (rys. 1C i F). Skóra właściwa została skomponowana w dużym stopniu z gęstej, niezorganizowanej tkanki łącznej, która obejmuje włókna kolagenowe o nieregularnym kształcie i większą średnicę (rys. 1F). W celu dalszego doprecyzowania różnic w strukturze histologicznej między tkanką normalną, krawędzią rany i przerostową blizną, przeprowadzono barwienie srebrem metenaminy w celu oceny tworzenia się BM, co wskazywało, że struktura BM była wykrywalna w sekcjach tkanek normalnych i krawędziowych rany (Fig. 1G I H). W tkankach bliznowatych nie stwierdzono jednak barwienia BM (ryc.1i).

różnice w ekspresji markerów komórkowych w keratynocytach naskórka w prawidłowych, krawędziach rany i bliznach hipertroficznych

biorąc pod uwagę różnice morfologiczne obserwowane w prawidłowych, krawędziach rany i przerostowych tkankach bliznowych,zbadaliśmy, czy podstawowe keratynocyty wykazywały odmienne zachowanie komórkowe podczas tworzenia blizn. Początkowo wykonywaliśmy impregnację immunofluorescencyjną w celu wykrycia ekspresji CK10, CK14, CK5, ck19 i integryny-β1 w sekcjach tkanek prawidłowych, krawędzi rany i dróg oddechowych. Wcześniejsze badania potwierdziły, że CK10 jest markerem zróżnicowanych keratynocytów, że ck14 i CK5 są markerami proliferacji bazalnych keratynocytów lub TAs, oraz że ck19 jest markerem aputacyjnym komórek progenitorowych naskórka lub komórek macierzystych w skórze (14-17). Uważa się również, że integryna-β1 jest prekursorem komórek prekursorowych w skórze (18,19). Nasze wyniki wykazały, że CK10 ekspresowano w zewnętrznej warstwie naskórka w tkankach prawidłowych i brzegowych (rys. 2A IB), a w komórkach nadbasalnych, różnicujących się terminalnie w naskórku przerostowej tkanki bliznowatej (Fig. 2C). CK14 wyrażano zarówno w warstwie zasadowej, jak i nadpodstawowej w warstwowym naskórku wszystkich trzech tkanek (Fig. 2D-F) i stwierdzono rozległą dystrybucję CK14 w wielowarstwowym naskórku tkanki bliznowatej (Fig.2F). Wzór rozkładu CK5 był podobny do tego zck14 (Fig. 2G-I), co wskazywałoby na zwiększoną liczbę proliferujących komórek w hiperproliferacyjnym naskórku. Integrynę β1 i CK19 ekspresowano w warstwie podstawowej normalnego naskórka (Fig. 2J I M) oraz w warstwie podstawno-podstawnej naskórka krawędzi rany (rys. 2K i N), ale nie były wykrywalne w naskórku przerostowych tkanek blizn (Fig. 2L I O). Łącznie te obserwacje wskazują, że profil ekspresji keratyny bazalkeratynocytów różnił się między normalną krawędzią rany a bliznami nadprzestrzennymi. Chociaż mniej komórek ekspresji CK19 wykryto w warstwie podstawowej i nadbasalnej blizny hipertroficznej (Fig.2P), fenotyp proliferacyjny ujawniono z powodu zwiększonej ekspresji CK14 i CK5 w wielowarstwowym naskórku.

zmieniona struktura BM przyczynia się do zróżnicowanego profilu ekspresji keratyny w keratynocytach naskórka in vivo

jako kluczowy składnik niszy komórek macierzystych, ECMnot tylko kotwiczy komórki macierzyste, ale także kieruje ich losem (20). Jak wspomniano powyżej, struktura histologiczna BM wydaje się być nieobecna w próbkach blizny hipertroficznej. Biorąc pod uwagę różnice w profilach ekspresji keratyny w warstwie podstawowej normalnego, zranionego i przerostowego naskórka blizny, spekulowaliśmy, że nieprawidłowości strukturalne BM odgrywają rolę w regulowaniu decyzji o losie komórek keratynocytów bazalnych podczas gojenia się ran. Aby zbadać tę hipotezę, przeprowadzono barwienie immunofluorescencyjne w celu zobrazowania składników BM w próbkach normalnej, krawędzi rany i blizny hipertroficznej. Nasze wyniki wykazały, że ekspresja Collagen IV została wykryta w obszarze BM W obu normach (Fig. 3A) i krawędź rany (rys. 3b) chusteczki. Jednak w naskórku przerostowych blizn obserwowano powstawanie struktur podobnych do BM z brakiem ekspresji kolagenu (Fig. 3C). Chociaż ekspresję lamininy wykryto we wszystkich trzech typach tkanek (Fig. 3D-F), podwójne znakowanie lamininy-5 i jej receptora integryny-β4 dodatkowo potwierdziło nasze zastrzeżenie, że struktura BM została zmieniona w naskórku przerostowych tkanek blizn; negatywne zabarwienie lamininy-5 i integryny-β4 (Fig.3i i 4G–I) zaobserwowano w porównaniu z tym w normie (Fig. 3G i 4A–C) i tkanek brzegowych rany (Fig. 3H i 4D–F). Biorąc pod uwagę te wyniki, jest prawdopodobne, że normalny BM przyczynił się do rekrutacji komórek wykazujących ekspresję integryny-β1 i CK19 w warstwie bazalnej naskórka o normalnej i zaokrąglonej krawędzi. Nieprawidłowości w strukturze BM, jednak, indukował bazalnych keratynocytów do różnicowania i przyjęcia aproliferacyjnego fenotypu podczas patogenezy blizn.

zmieniona struktura BM Promuje naskórkowe kalkeratynocyty w celu przyjęcia proliferacyjnego fenotypu in vitro

mechaniczne wsparcie zapewniane przez BM jest określone głównie przez jego rusztowanie kolagenowe typu IV (21), w które sieci lamininowe i oligomery perekanu są zintegrowane przez sieciujące nidogeny, aby ostatecznie złożyć arkuszowy kompleks BM (22). Aby jeszcze bardziej wyjaśnić rolę bm w regulacji zachowania keratynocytów naskórka, użyliśmy ECM pochodzącego z ekstraktu ludzkiego BM do powlekania naczyń kulturowych w celu kontrolowania wzoru adhezji komórek do matrycy. Jak pokazano wfig. 5, ECM administrowanie w górę regulacji ekspresji integryny-β4 w Heksach (rys. 5A) i hacat (rys. 5B) komórki, które były obecne na błonie plazmy i w miejscach przyłączenia komórki do matrycy. Przeprowadziliśmy również analizę western blot w celu zbadania poziomu białka intergryny-β4 w liniach komórkowych naskórka z lub bez ECMcoating. Nasze dane wykazały, że wyższe poziomy integryny-ß4 były wykrywalne w grupach leczonych ECM niż w grupach kontrolnych, co dodatkowo potwierdziło wyniki dotyczące fluorescencyjnego immunostiftingu (Fig. 5C). Ponadto komórki HEKs ihacat przestawiono na podłoże zawierające 1,5 mMCa2+ na wskazany okres czasu, aby wygenerować różne komórki naskórka, jak opisano wcześniej (23,24). Po leczeniu Ca2+, zmiany morfologiczne w obu Heksach (rys. 6A) i komórki HaCaT (rys. 6b) obserwowano pod mikroskopem świetlnym, który obejmował powiększenie i spłaszczenie komórek.Ca2+ wywołał ekspresję CK10 (Fig. 5D, G I J oraz 6C i D) i CK14 (Fig. 5E, H I J oraz 6C i D)w zależny od czasu sposób inepidermalne linie komórkowe w obu mRNA (Fig. 5D, E, G I H oraz 6C i D) i białka (rys. 5J), z maksymalnymi poziomami ekspresji Ck10 i ck14 obserwowanymi 24 godziny po rozpoczęciu leczenia 1,5 mMCa2+ w Heksach (Fig . 5D, E I J oraz 6C) oraz komórki HaCaT (Fig. 5G, H I J oraz 6D). Po leczeniu Ca2+ ekspresja CK19 zmniejszała się w HEKs, osiągając najniższy poziom po 24 godzinach od rozpoczęcia leczenia Ca2+ (Fig. 5F I J oraz 6C). Podobne wyniki zaobserwowano w komórkach hakatów (Fig. 5I I J and6D). Jednak leczenie ECM zmniejszyło odpowiedzi różnicujące keratynocytów związanych z podaniem Ca2+ w komórkach HEKs i HaCaT oraz zwiększyło ekspresję CK19 po 12 i 24 godzinach po leczeniu Ca2+ (Fig. 5F, Iand J). W celu dalszego określenia potencjalnej roli BM w regulacji zachowania keratynocytów naskórka, kolagen typu IV został użyty do utworzenia struktury podobnej do BM in vitro. Leczenie kolagenem IV przyczyniło się do ekspresji CK19 i zmniejszyło ekspresję CK10 i CK14 na poziomie mRNA i białka w obu komórkach Hek (Fig. 7A-C i G) i HaCaTcells (rys. 7D-F I G). Wyniki te potwierdziły ponadto nasze wyniki in vivo, zgodnie z którymi BM wydaje się być pozytywnym regulatorem rekrutacji komórek przypominających rogówki w warstwie bazalnej naskórka.Zmiany w strukturze BM sprzyjały rozwojowi fenotypu aproliferacyjnego w keratynocytach bazalnych, na co wskazuje zwiększona ekspresja markerów związanych z proliferacją komórek, np. CK14 i CK5.

dyskusja

w niniejszym opracowaniu najpierw zbadaliśmy te zmiany, które zachodzą podczas regeneracji naskórka w aspekcie procesu gojenia się ran. Nasze dane wykazały, żehistologiczna struktura przerostowych tkanek blizn różni się od normalnej tkanki skóry, ze znacznym wzrostem grubości naskórka między warstwą podstawną a warstwą rogową. W szczególności, barwienie BM wydawało się absentin blizny. Ponadto, barwienie immunofluorescencyjne dla CK10,CK14, CK5, CK19 i integrin-β1 wskazało, że różnicowa ekspresja markerów bazalnych keratynocytów różniła się między próbkami normalnych, krawędzi rany i przerostowych tkanek blizn, a ponadto naskórek przerostowej tkanki blizn wykazywał fenotyp proliferacyjny, zmieniając ekspresję integryny-β1 i CK19 na ck14 i CK5, markery proliferacji komórek, w wielowarstwowych komórkach.naskórek. Biorąc pod uwagę te ustalenia, postawiliśmy więc hipotezę, że BM odgrywa rolę w regulowaniu decyzji o losie keratynocytów naskórka podczas rany healing.By wykorzystując panel przeciwciał związanych ze składnikami BM, potwierdziliśmy naszą hipotezę, że struktura BM została zmieniona w przerostowych tkankach blizn. Nasze wyniki wykazały, że BMC przyczyniły się do rekrutacji komórek ekspresyjnych CK19 w podstawowej warstwie normalnego i krawędzi rany naskórka, w której nieprawidłowości w strukturze BM indukowały bazalkeratynocyty do różnicowania i przyjęcia proliferacyjnej fenotypowej patogenezy blizn. Używając ECM i kolagenu IV do naśladowania struktury BM in vitro, potwierdziliśmy nasze obserwacje invivo i pokazaliśmy, że BM zmniejszył zróżnicowane odpowiedzi keratynocytów indukowane przez podanie Ca2+ w liniach komórkowych naskórka i zwiększył ekspresję ck19, przypuszczalnego markera komórek progenitorowych naskórka.

BM odgrywa zasadniczą rolę w zróżnicowaniu, proliferacji, przeżywalności i migracji komórek podczas rozwoju embrionalnego. W skórze BM fizycznyoddziela naskórek od skóry właściwej. Bazalkeratynocyty w naskórku przyłączają się do leżącego poniżej BM poprzez integryny, które wiążą się z niektórymi składnikami BM,takimi jak kolagen, laminina i fibronektyna (25).Tak więc BM nie tylko służy jako selektywna bariera i struktura, ale także zapewnia interfejs komunikacyjny między fibroblastami i keratynocytami naskórka (2,26).BM wiąże się również z wieloma cytokinami i czynnikami wzrostu,służąc jako rezerwuar dla ich kontrolowanego uwalniania, który reguluje interakcje keratynocyt-fibroblast w celu promowania rozwoju skóry, a także gojenia się ran (27,28). Wcześniejsze badania nad powstawaniem blizn koncentrowały się głównie na fibroblastach i niewiele wiadomo o roli leżących naskórkowych keratynocytów (29,30). Istnieje coraz więcej dowodów na to, że keratynocyty mogą odgrywać ważną rolę w rozwoju patologicznego zwłóknienia poprzez parakrynną regulację fibroblastów (6,9,10).wykazano również, że keratynocyty pochodzące z tkanek bliznowych różnią się od normalnych keratynocytów poprzez wykazywanie różnicowych profili ekspresji genów (12). Mechanizmy odpowiedzialne za podstawowe nieprawidłowości inkeratynocytów podczas keloidów i przerostowych blizn pozostają niezmienne. Nasze dane wskazały na potencjalny związek między przebudową BM a utrzymaniem funkcji keratynocytów podczas naprawy i regeneracji ran. Powszechnie wiadomo, że cząsteczki adhezyjne, takie jakintegryny oraz E-i N-kadheryna, zakotwiczają komórki macierzyste w ECM(22). W świetle naszych badań wydaje się, że BM może stanowić część składową komórek progenitorowych nabłonka w warstwie podstawnej naskórka. Nasze wyniki wskazują, że nieprawidłowe funkcjonowanie BM zmniejsza przywiązanie komórek bazalprogenitorowych do otaczającego ich mikrośrodowiska i indukuje je do przyjęcia proliferacyjnego fenotypu, który może odpowiadać za patogenezę blizn (rys.8).

podziękowania

badanie to było częściowo wspierane przez granty programu Novel z Pekinu (nr 2008b53 i 2009a38) oraz National Natural Science Foundation Of China (nr 30901564,81101883, 81372067, 81121004 i 81230041) oraz National BasicScience and program rozwoju (973 program, 2012cb518105).

	Fuchs E i Raghavan s: poddanie się morfogenezie naskórka. Nat Rev Genet. 3:199–209. 2002.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Breitkreutz D, Mirancea n i Nischt R: membrany piwniczne w skórze: unikalne struktury matrycowe z różnymi funkcjami? Biol Komórek Histochemowych. 132:1–10. 2009. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Blanpain C i Fuchs E: naskórkowe komórki macierzyste skóry. Annu Rev Cell Dev Biol. 22:339–373. 2006.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Snippert HJ, Haegebarth a, Kasper m, JaksV, van Es JH, Barker N, van de Wetering M, van den Born m, BegthelH, Vries RG, et al: Lgr6 oznacza komórki macierzyste w mieszku włosowym, które generują wszystkie linie komórkowe skóry. Nauka. 327:1385–1389.2010. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Broughton G II, Janis JE and Attinger CE: the basic science of wound healing. Plast Reconstr. 117 (Suppl7): 12S-34S. 2006. Zobacz Artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Bellemare J, Roberge CJ, Bergeron D, Lopez-Vallé CA, Roy m i Moulin VJ: naskórek Promuje włóknienie skóry: rolę w patogenezie przerostowych blizn. J Pathol.206:1–8. 2005. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Andriessen MP, Niessen FB, Van de KerkhofPC i Schalkwijk J: Hypertrophic scarring is associated withepidermal aberrations: an immunohistochemical study. J Pathol.186:192–200. 1998. Zobacz Artykuł : Google Scholar
	Teepe RG, Kreis RW, Koebrugge EJ, Kempenaar ja, Vloemans AF, Hermans RP, Boxma H, Doktor J, HermansJ, Ponec m, et al: the use of cultured autologous epidermis in the treatment of extently burn wounds. J Trauma. 30:269–275. 1990.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Funayama E, Chodon T, Oyama a i SugiharaT: keratynocyty wspomagają proliferację i hamują apoptozę fibroblastów: odgrywają ważną rolę w patogenezie fibroblastów. J Invest Dermatol. 121:1326–1331. 2003. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Lim IJ, Phan TT, Bay BH, Qi R,Huynh H, Tan WT, Lee ST i Longaker MT: fibroblasty otoczone keloidkeratynocyty: normalne fibroblasty wydzielają kolagen w keloidlikemanner. Am J Physiol Cell Physiol. 283: C212-C222. 2002. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Hahn JM, Glaser K, McFarland KL, AronowBJ, Boyce ST i Supp DM: Keratynocyty pochodzące od keloidów wykazują anabnormalny profil ekspresji genu zgodny z wyraźnym czynnikiem przyczynowym w patologii keloidów. Regeneracja Ran. 21:530–544. 2013.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Machesney M, Tidman N, Waseem a, Kirby Land Leigh I: aktywowane keratynocyty w naskórku blizn hipertroficznych. Am J Pathol. 152:1133–1141. 1998.PubMed / NCBI
	Orazizadeh M, Hashemitabar M, BahramzadehS, Dehbashi FN oraz Saremy S: Porównanie metod enzymatycznych iplantowych dla hodowli keratynocytów wyizolowanych z napletka człowieka. Biomed Rep. 3: 304-308. 2015.PubMed / NCBI
	Su L, Morgan PR i Lane EB: ekspresja keratyny 14 i 19 w normalnej, dysplastycznej i złośliwej oralepitelii. Badanie wykorzystujące hybrydyzację in situ iimmunohistochemię. J Oral Pathol Med. 25:293–301. 1996.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Michel m, Török N, Godbout MJ,Lussier m, Gaudreau P, Royal A i Germain L: Keratyna 19 jako biochemiczny marker komórek macierzystych skóry in vivo i in vitro: komórki ekspresyjne keratyny 19 są różnie zlokalizowane w funkcji miejsc anatomicznych,a ich liczba zmienia się w zależności od wieku dawcy i kultury. J Cell Sci. 109:1017–1028. 1996.PubMed / NCBI
	Khanom R, Sakamoto K, Pal SK,Shimada y, Morita K, Omura K, Miki Y i Yamaguchi a: ekspresja podstawowej cellkeratyny 15 i keratyny 19 w płaskonabłonkowych nowotworach jamy ustnej reprezentuje odmienne patofizjologie. Histol Histopatol. 27:949–959.2012.PubMed / NCBI
	Fuchs E: Skin stem cells: rising to thesurface. J Cell Biol. 180:273–284. 2008. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Yeh YC, Lin HH and Tang MJ: a tale of twocollagen receptors, integrin β1 and discoidin domain receptor 1, inepitelial cell differentiation. Am J Physiol Cell Physiol.303: C1207-C1217. 2012. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Borowska K, Jędrych B, Czerny k, andZabielski S: Rola integryn w procesach fizjologicznych i patogennych. Pol Merkur Lekarski. 21:362–366. 2006.Artykuł W Języku Polskim.
	Lane SW, Williams DA I Watt FM: modulowanie niszy komórek macierzystych do regeneracji tkanek. NatBiotechnol. 32:795–803. 2014. Zobaczartykuł: Google Scholar: PubMed / NCBI
	Breitkreutz D, Koxholt i, Thiemann k andNischt r: Skin basement membrane: the foundation of epidermalintegrity-BM functions and diverse role of bridging moleculesnidogen and perlecan. Biomed Res Int. 2013(179784)2013. Zobacz artykuł: Google Scholar
	Timpl R I Brown JC: Supramolekularny montaż membran piwnicznych. BioEssays. 18:123–132. 1996.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Hennings H, Michael D, Cheng C, SteinertP, Holbrook K and Yuspa SH: Calcium regulation of growth anddifferentiation of mouse epiderm cells in culture. Cell.19:245–254. 1980. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Hennings H I Holbrook KA: Calciumregulation of cell-cell contact and differentiation of epidermalcells in culture. Badanie ultrastrukturalne. Exp Cell Res. 143: 127-142. 1983. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Burgeson RE and Christiano AM: The Redermal-epiderm junction. Curr Opin Cell Biol. 9:651–658. 1997.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	LeBleu VS, Macdonald B i Kalluri R: struktura i funkcja membran piwnicznych. Exp Biol Med(Maywood). 232:1121–1129. 2007. Zobacz Artykuł : Google Scholar
	Iozzo RV: proteoglikany membran piwnicznych: od piwnicy do sufitu. Nat Rev Mol Cell Biol. 6:646–656. 2005.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Werner S, Krieg T i Smola H: interakcje Keratynocyt-fibroblasty w gojeniu ran. J InvestDermatol. 127:998–1008. 2007. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Moulin V, Castilloux G, Auger FA, GarrelD, O ’ Connor-McCourt m i Germain L: Modulowana odpowiedź na cytokiny gojących się ludzkich ran miofibroblastów w porównaniu do dermalfibroblastów. Exp Cell Res. 238: 283-293. 1998. Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI
	Gabbiani G, Ryan GB i Majne G: presence of modified fibroblasts in granulation tissue and their possible in wound contraction. Experientia. 27:549–550. 1971.Zobacz artykuł: Google Scholar : PubMed / NCBI