International Journal of Molecular Medicine

Einführung

Die Haut dient als physikalische und chemische Barriere zwischen dem inneren Körper und der äußeren Umgebung, die aus einer darunter liegenden Dermis mesodermalen Ursprungs und einer darüber liegenden Epidermis ektodermalen Ursprungs besteht. Obwohl diese beiden Schichten unterschiedliche Funktionen erfüllen, kommunizieren sie auf verschiedene Arten und auf verschiedenen Ebenen. Die lebenswichtige Barrierefunktion der Haut wird in erster Linie durch ihre obere geschichtete Epidermis gewährleistet, die aus proliferierenden basalen und differenzierten suprabasalen Keratinozyten besteht (1). Um diese Funktionen zu erfüllen,sind Stammzellen in der Basalschicht in der Lage, sich während des gesamten Lebens selbst zu erneuern, und sie produzieren Tochterzellen, die differenziert werden (2). Somit ist das Gleichgewicht zwischen der Proliferation und Differenzierung der basalen Keratinozyten für die epidermale Integrität von wesentlicher Bedeutung und gewährleistet das Auftreten einer Gewebeerneuerung, die zur Vervollständigung normaler physiologischer Funktionen erforderlich ist. Neben der Aufrechterhaltung der Gewebehomöostase sind Stammzellen, die sich in der Epidermis und den Haarfollikeln befinden, auch an der Reparatur der Epidermis nach einer Verletzung beteiligt (3,4).In der Haut entwickeln sich verschiedene Phasen der Wundheilung in dynamischen Wechselwirkungen zwischen Epidermiszellen, Hautzellen und aus Knochenmark gewonnenen Zellen. Keratinozyten stellen die erste Verteidigungslinie des Körpers gegen die äußere Umgebung dar. Daher sind sie die Ersthelfer bei Verletzungen. Mit der Freisetzung entzündlicher Zytokine und der Kontraktion kollagener Fasern werden die basalen epidermalen Keratinozyten aktiviert und wandern in den Wundbereich, wo sie sich vermehren und differenzieren, bis der zelluläre Inhalt des Gewebes erneuert wurde (5). Eine Reihe von Beobachtungen haben gezeigt, dass die Epidermis einen Einfluss auf die Pathologie der Hautnarben hat (6,7). Bei Verbrennungspatienten treten hypertrophe Narben häufiger auf, wenn Wunden durch sekundäre Absicht heilen, während eine frühe Hauttransplantation die Narbenbildung zu unterdrücken scheint (8). Funayama et aldemonstrierten, dass keloid-abgeleitete Fibroblasten, die mit Keloid-abgeleiteten Keratinozyten kokultiviert wurden, signifikant proliferativer und resistenter gegen Apoptose waren als solche, die mit normalen Haut-abgeleiteten Keratinozyten kokultiviert wurden (9).In einem ähnlichen Kokultursystem wurde festgestellt, dass Keloid-abgeleitete Keratinozyten eine erhöhte Kollagenproduktion sowie die erhöhte Proliferation normaler Fibroblasten förderten (10). Insbesondere wurde gezeigt, dass keloid-derivierte Keratinozyten die erhöhte Expression eines Satzes von Histongenen aufweisen, die für die DNA-Replikation im Vergleich zu den Expressionsniveaus in normalen Zellen essentiell sind, Undkeratinozyten in der Epidermis hypertropher Narben sind in einen alternativen Differenzierungsweg eingetretenund exprimieren einen proliferativen Phänotyp (11,12). Diese Ergebnisse legen nahe, dass das Gleichgewicht zwischen der Proliferation und Differenzierung von Keratinozyten in Narbengeweben gestört ist und dass fundamentale Anomalien in Keratinozyten eine wichtigere Rolle bei der Regeneration der Haut und ihrer Pathogenese spielen können als bisher angenommen.

In der vorliegenden Studie wurden normale, Wundrand- und hypertrophe Narbengewebe gewonnen und mit Hilfe von histologischen und Immunfluoreszenzmethoden analysiert, um die Unterschiede in der Morphologie sowie die Keratinexpressionsprofile während der epidermalen Regeneration zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Keratinexpressionsprofile in den epidermalen Keratinozyten gegenüber normalen, Wundrand- und hypertrophen Narbengeweben variierten, was mit Anomalien in der Struktur der Basalmembran (BM) korrespondierte. Durch die Verwendung eines Panels von Antikörpern gegen BMKOMPONENTEN validierten wir unsere Hypothese und stellten fest, dass das BMwas ein positiver Regulator der Rekrutierung von vorläuferähnlichen Zellen in der Basalschicht der Epidermis ist. Unsere Daten zeigen dasveränderungen in der Struktur des BM fördert die basale Keratinozytoseeinen proliferativen Phänotyp sowohl in vivo als auch invitro annehmen.

Materialien und Methoden

Gewebeproben

Hypertrophe Narbengewebe (4 Frauen und 3 Männer; Altersbereich 18-40 Jahre) und Wundrandgewebe (3 Frauen und 5 Männer; Altersbereich 18-40 Jahre) Proben wurden von Patienten erhalten, die eine vorherige rekonstruktive Verbrennungsoperation hinter sich hatten. Normales Hautgewebe (4 Frauen und 3 Männer; Altersspanne, 18-40 Jahre) neben der Scarexcision während der Operation wurde als Kontrolle verwendet. Vorhaut wurde auch von Männern erhalten, die sich einer Beschneidung unterzogen (10 Männer; Altersspanne, 18-20 Jahre). Die vorliegende Studie wurde vom Ethikausschuss des chinesischen PLA General Hospital (Peking, China) genehmigt, und von allen Personen wurde vor der Entnahme der Proben eine schriftliche Einverständniserklärung eingeholt.

Immunfluoreszenzfärbung

Normale Haut, Wundrand und hypertrophe Narbengewebeproben wurden in 10% gepuffertem Formalin fixiert, nacheinander durch Ethanollösungen mit erhöhter Konzentration dehydriert und schließlich in Paraffin eingebettet. Paraffin-eingebettete Gewebe wurden in 4 µm dicke Schnitte geschnitten, um mit Hämatoxylin und Eosin (H & E), Massons Trichrom und Methenaminsilber (alle von Zhongshan Golden Bridge, Peking, China) gefärbt zu werden. Die Bilder wurden mit einem optischen Mikroskop (BX53; Olympus, Tokio, Japan) aufgenommen. Zur Durchführung einer Immunfluoreszenzfärbung wurden die Abschnitte 30 min in 4% Paraformaldehyd fixiert und dann 10 min in 0,2% Triton X-100 (T8787; Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) permeabilisiert. Die Abschnitte wurden mit primären Antikörpern bei 4 ° C über Nacht und dann mit sekundären Antikörpern für 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: mouse anti-humancytokeratin (CK)10 (1:200, ab111447) und rabbit anti-human CK14 (1:200, ab7800) (beide von Abcam, Cambridge, MA, USA), rabbitanti-human CK5 (1:200, ZA-0518; Zhongshan Goldenbridge, Beijing, China), mouse anti-human CK19 (1:200, ab53119; Abcam), Kaninchenanti-menschliches Integrin-β1 (1:200, PB0063; Boster, Wuhan, China); Mausanti-menschliches integrin-β4 (1:200, ab128068; Abcam), mausanti-menschliches laminin (1:200, ZM-0181; Zhongshan Goldenbridge), Kaninchen-Anti-Humanlaminin-5 (1:200, ab14509; Abcam) und Maus-Anti-Human-Kollagen IV (1:200, ZM-0081; Zhongshan Goldenbridge). Folgende Secondaryantikörper wurden verwendet: Alexa-Fluor 488-konjugiertes Anti-Maus (1:200, ab150117) und Alexa-Fluor 594-konjugiertes Anti-Kaninchen (1:200, ab150080) (beide von Abcam). Die Kerne wurden mit DAPI (H-1200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) angefärbt.Immunfluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop (SP8; Leica, Solms, Deutschland) aufgenommen.

Zellkultur und Behandlung

Primäre humane epidermale Keratinozyten (HEKs) wurden wie zuvor beschrieben (13) mit geringfügigen Modifikationen aus den männlichen Vorhäuten isoliert. Die humanimmortalisierten Keratinozyten (HaCaT)-Zellen wurden von der China Infrastruture of Cell Line Resources (3111C0001CCC000373; Peking, China) erworben. Sowohl die HEKs- als auch die HaCaT-Zellen wurden in EpiLife-Medium (M-EPI-500-CA; Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) inkubiert, ergänzt mit 0,06 mM Ca2 +, 1% EpiLife Defined Growth Supplement (S-001-5; Invitrogen LifeTechnologies) und 1% Penicillin/Streptomycin (P1400; Solarbio, Beijing, China). Um die Rolle des BM bei der Regulierung des Keratinozytenverhaltens in vitro zu untersuchen, wurden die HEKs- und HaCaT-Zellen in 60 mm-Schalen plattiert, die mit MaxGel ECM (E0282) bzw. Collagen Typ IV (C7521) (beide von Sigma-Aldrich) beschichtet waren.Zur Ca2+-Behandlung wurden die Zellen in EpiLifemedium mit 1,5 mM Ca2+ für 0, 12 und 24 h inkubiert.Das MaxGel ECM enthält Komponenten der menschlichen extrazellulären Matrix (ECM), einschließlich Kollagene, Laminin, Fibronektin, Tenascin und Elastin sowie eine Reihe von Proteoglykanen und Glykosaminoglykanen. Die nicht mit Ca2+ behandelten Zellen wurden als Kontrollen verwendet.

Reverse Transkription-quantitative (Real-time) PCR (RT-qPCR)

Gesamt-RNA wurde aus den Zellen isoliert, nachdem sie den verschiedenen Behandlungen mit TRIzol-Reagenz (15596-026; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) und dann cDNA wurde mit GoScript Reverse Transkriptase (A5001) synthetisiert; Promega, Madison, WI, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die zur Genamplifikation verwendeten Primersequenzen sind in Tabelle I aufgeführt. qPCR-Reaktionen wurden mit GoTaq qPCR Master Mix (A6001; Promega) unter Verwendung eines Echtzeit-PCR-Systems ABI 7500 und einer Software (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Das Reaktionsprotokoll bestand aus folgenden Zyklen: 95°C für 15 sec, 55°C für 30 sec und 72°C für 30 sec für 40 Zyklen PCR-Amplifikation.

Western Blot Analyse

Aus den Zellen wurde Gesamtprotein isoliert und 20µg Protein in substratlöslichem Puffer gelöst. Die Proteine wurden dann durch SDS-PAGE getrennt und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (IPFL00010; Millipore, Billerica, MA, USA) übertragen. Nach der Blockierung wurden die Blots mit den primären Antikörpern über Nacht bei 4 °C untersucht. Die für die Western-Blot-Analyse verwendeten Antikörper umfassten CK10 (1:1000, ab111447), CK14 (1:500, ab7800), CK19 (1:500, ab53119), Integrin-β4 (1:500, ab128068) und Maus-Anti-Human-β-Aktin-Antikörper (1:5000, ab6276) (alle von Abcam). Nach dem Waschen wurden die Membranen mit inkubiert sekundäre Antikörper, die Ziegen-Anti-Kaninchen- und Ziegen-Anti-Maus-IgG waren, konjugiert an Meerrettichperoxidase (sc-2004,1: 1000; sc-2005, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Immunreaktive Banden wurden mittels enhancedchemiluminescence (ECL) Kit (PE-0010-100; Solarbio, Beijing, China) nachgewiesen und mit dem ImageQuant LAS 4000 System (GE HealthcareBio-Sciences, Pittsburgh, USA) abgebildet.

Statistische Analyse

Alle Experimente wurden mindestens 3 mal wiederholt, sofern nicht anders angegeben. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Die statistische Analyse wurde mit DURCHGEFÜHRTSPSS 20.0 Software. Der Datenvergleich wurde unter Verwendung des T-Tests des unabhängigen Studenten und der Einweg-ANOVA durchgeführt, gefolgt vom LSD-Test. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikanter Unterschied angesehen.

Ergebnisse

Morphologische Unterschiede in normalem, Wundrand- und hypertrophen Narbengewebe

Hautwundenreparatur ist ein präziser Remodellierungsprozess, der klassisch in vier überlappende Phasen unterteilt ist und das Zusammenspiel vieler verschiedener Gewebe und Zelllinien beinhaltet (5). Bei chronischen Wunden wird jedoch der normale Heilungsprozess unterbrochen, was zu einem pathologischen Zyklus von Entzündung und Proteasefreisetzung führt, der zur Entwicklung einer pathologischen Narbe führt. In dieser Studie wurden zur Bewertung der morphologischen Veränderungen, die in der regenerierenden Epidermis während der Wundheilung der Haut auftreten, Proben von normalem, wundem und hypertrophen Narbengewebe erhalten, um die Routine H & E und Massons Trichromfärbung durchzuführen. In den normalen Hautproben war die histologische Struktur der Haut sichtbar und zeigte Schichten der Epidermis und Dermis. Die Epidermieenthielt 4 bis 5 Schichten, in denen Keratinozyten differenzierten undallmählich während ihres Durchgangs nach außen zu Dornzellen, körnigen Zellen und verhornten Zellen reiften (Abb. 1A). Darüber hinaus bildeten Fibroblasten in der Unterhaut lockeres Bindegewebe, das reich an parallelen kollagenen Fasern war (Abb.1D). In den Geweben um den Wundrand wucherte die Epidermis jedoch; sie bestand aus mehreren Schichten Keratinozyten unterschiedlicher Morphologie und war von sichtbar erhöhter Dicke (Abb. 1B und E). Dasepidermis und Dermis verzahnten sich durch fingerartige Vorsprünge(sogenannte Rete-Grate), die die Kontaktfläche zwischen Epidermis und Dermis vergrößerten. Sowohl im normalen als auch im verwundeten Gewebe waren die basalen Keratinozyten als eine einzige Schicht quaderförmiger oder niedrigsäulenförmiger Zellen angeordnet, die mit den darüber liegenden Dornzellschichten verbunden waren (Abb.1A und B). Die histologische Struktur des hypertrophen Narbengewebes unterschied sich von der des normalen Hautgewebes durch eine reiche Blutversorgung und eine dicke epidermale Schicht (Abb. 1C und F). Die Dermis bestand größtenteils aus dichtem, unorganisiertem Bindegewebe, das durch kollagene Fasern mit unregelmäßiger Form und größerem Durchmesser (Abb. 1F). Zur weiteren Klärung der Unterschiede in der histologischen Struktur zwischen Normal-, Wundrand- und hypertrophen Narbengeweben wurde eine Methenamin-Silberfärbung durchgeführt, um die Bildung des BM zu beurteilen, was darauf hindeutete, dass die BM-Struktur in den Abschnitten des Normal- und Wundrandgewebes nachweisbar war (Abb. 1G und H). In den Narbengeweben fehlte jedoch eine BM-Färbung (Abb.1I).

Unterschiede in der Expression von Zellmarkern in epidermalen Keratinozyten in normalen, Wundrand- und hypertrophen Narbengeweben

Angesichts der morphologischen Unterschiede, die in den normalen, Wundrand- und hypertrophen Narbengeweben beobachtet wurden, untersuchten wir, ob die basalen Keratinozyten ein unterschiedliches zelluläres Verhalten während der Narbenbildung zeigten. Zunächst führten wir eine Immunfluoreszenzfärbung durch, um die Expression von CK10, CK14, CK5, CK19 und Integrin-β1 in den Abschnitten von normalem, Wundrand- und Skargewebe nachzuweisen. Frühere Studien haben bestätigt, dass CK10 ein markervon differenzierten Keratinozyten ist, dass CK14 und CK5 Marker für proliferierende basale Keratinozyten oder TAs sind und dass CK19 einutativer Marker für epidermale Vorläuferzellen oder Stammzellen in der Haut ist (14-17). Es wird auch angenommen, dass Integrin-β1 ein Marker für Vorläuferzellen in der Haut ist (18,19). Unsere Ergebnisse zeigten, dass CK10 in der äußeren Schicht der Epidermis in den normalen und gewickelten Randgeweben exprimiert wurde (Abb. 2A und B) und in den suprabasalen, endständig differenzierenden Zellen in der Epidermis des hypertrophen Narbengewebes (Abb. 2C). CK14 wurde sowohl in basalen als auch in suprabasalen Schichten in der geschichteten Epidermis aller drei Gewebe exprimiert (Abb. 2D-F), undes gab eine ausgedehnte Verteilung von CK14 in der mehrschichtigen Epidermis des Narbengewebes (Abb.2F). Das Verteilungsmuster von CK5 war ähnlich dem von CK14 (Abb. 2G-I), die angezeigteine erhöhte Anzahl von proliferierenden Zellen in derhyperproliferativen Epidermis. Integrin-β1 und CK19 wurden exprimiertin der Basalschicht der normalen Epidermis (Abb. 2J und M) und in den basalen und supra-basalen Schichten der Wundrandepidermis (Abb. 2K und N), waren aber in der Epidermis der hypertrophen Narbengewebe nicht nachweisbar (Abb. 2L und O). Zusammenfassend weisen diese Beobachtungen darauf hin, dass sich das Keratinexpressionsprofil von Basalkeratinozyten zwischen normalem Wundrand und hypertrophen Narbengeweben unterscheidet. Obwohl weniger CK19-exprimierende Zellen in den basalen und suprabasalen Schichten des hypertrophen Narbengewebes nachgewiesen wurden (Abb.2P) wurde aufgrund der erhöhten Expression von CK14 und CK5 in der mehrschichtigen Epidermis ein proliferativer Phänotyp festgestellt.

Die veränderte BM-Struktur trägt zum differentiellen Keratinexpressionsprofil in epidermalen Keratinozytenin vivo bei

Als Schlüsselkomponente der Stammzellnische verankert das ECM nicht nur Stammzellen, sondern lenkt auch deren Schicksal (20). Wie oben erwähnt, schien die histologische Struktur des BM in den Proben des hypertrophen Narbengewebes zu fehlen. Angesichts der Unterschiede in den Keratin-Expressionsprofilen in der Basalschicht der normalen, verwundeten und hypertrophen Narbenepidermis spekulierten wir dann, dass die strukturellen Anomalien des BM eine Rolle bei der Regulierung der Zellschicksalsentscheidung der basalen Keratinozyten während der Wundheilung spielen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Immunfluoreszenzfärbung durchgeführt, um die Komponenten des BM in den normalen, Wundrand- und hypertrophen Narbengewebeproben sichtbar zu machen. Unsere Ergebnisse zeigten, dasscollagen IV-Expression wurde im BM-Bereich in beiden normal nachgewiesen(Abb. 3A) und Wundrand (Fig. 3B) Gewebe. Die Bildung von BM-ähnlichen Strukturen ohne Kollagen IVexpression wurde jedoch in der Epidermis hypertropher Narbengewebe beobachtet (Abb. 3C). Obwohl die Expression von Laminin in allen drei Gewebetypen nachgewiesen wurde(Abb. 3D-F) bestätigte die Doppelmarkierung von Laminin-5 und seinem Rezeptor Integrin-β4 unsere Beobachtung, dass die Struktur des BM in der Epidermis des hypertrophen Narbengewebes verändert war; negative Färbung von Laminin-5 und Integrin-β4 (Abb.3I und 4G-I) wurde im Vergleich zu dem im Normalfall (Fig. 3G und 4A-C) und Wundrandgewebe (Fig. 3H und 4D-F). Angesichts dieser Befunde ist es wahrscheinlichdass das normale BM zur Rekrutierung von Integrin-β1- und CK19-exprimierenden Zellen in der Basalschicht der normalen undgewickelten Randepidermis beitrug. Anomalien in der BM-Struktur veranlassten jedoch die basalen Keratinozyten, sich während der Narbenpathogenese zu differenzieren und einen aproliferativen Phänotyp anzunehmen.

Veränderte BM-Struktur fördert Epidermalkeratinozyten, um in vitro einen proliferativen Phänotyp anzunehmen

Die mechanische Unterstützung durch das BM wird hauptsächlich durch sein Kollagengerüst vom Typ IV (21) bestimmt, in das die Lamininnetzwerke und Perlecanoligomere durch die vernetzenden Nidogene integriert werden, um schließlich den blattförmigen BM-Komplex (22) zusammenzusetzen. Um die Rolle des BM bei der Regulation des epidermalen Keratinozytenverhaltens weiter zu klären, verwendeten wir das aus humanem BM-Extrakt gewonnene ECM, um die Kulturschalen zu beschichten, um das Muster der Zell-Matrix-Adhäsion zu steuern. Wie in Fig. 5, ECM-Verwaltung resultierte in der Hochregulierung der Integrin-β4-Expression im HEKs (Abb. 5A) und dem HaCaT (Fig. 5B) Zellen, die auf Derplasmamembran und an den Stellen der Zell-Matrix-Bindung vorhanden waren. Wir führten auch eine Western-Blot-Analyse durch, um die Proteinspiegel von Integrin-β4 in den epidermalen Zelllinien mit oder ohne ECM-Beschichtung zu untersuchen. Unsere Daten zeigten, dass in den ECM-behandelten Gruppen höhere Konzentrationen von Integrin-ß4 nachweisbar waren als in den Kontrollen, was die fluoreszierenden Immunfärbungsbefunde weiter bestätigte (Abb. 5C). Darüber hinaus wurden die HEKs- und HACAT-Zellen für die angegebenen Zeiträume auf Medium umgestellt, das 1,5 mMCa2 + enthielt, um wie zuvor beschrieben differenzierende Epidermiszellen zu erzeugen (23,24). Nach Ca2+-Behandlung zeigten sich die morphologischen Veränderungen in beiden HEKs (Abb. 6A) und HaCaT-Zellen (Fig. 6B) wurden unter einem Lichtmikroskop beobachtet, das eine Zellvergrößerung und -abflachung beinhaltete.Ca2+ induzierte die Expression von CK10 (Abb. 5D, G und J sowie 6C und D) und CK14 (Fig. 5E, H und J sowie 6C und D) inepidermalen Zelllinien sowohl an der mRNA (Fig. 5D, E, G und H sowie 6C und D) und Protein (Fig. 5J), wobei Spitzenwerte der ck10- und CK14-Expression 24 h nach Beginn der 1,5 mMCa2 + -Behandlung im HEKs beobachtet wurden (Abb. 5D, E und J und 6C) und die HaCaT-Zellen (Fig. 5G, H und J und 6D). Nach der Ca2+ -Behandlung wurde die Expression von CK19 im HEKs herunterreguliert und erreichte 24 h nach Beginn der Ca2+ -Behandlung ihr niedrigstes Niveau (Abb. 5F und J und 6C). Ähnliche Ergebnisse wurden in den Hacat-Zellen beobachtet (Abb. 5I und J und 6D). Die ECM-Behandlung reduzierte jedoch die differenzierenden Reaktionen von Keratinozyten, die mit der Ca2 + -Verabreichung in den HEKs- und HaCaT-Zellen assoziiert waren, und verstärkte die Expression von CK19 nach 12 h und 24 h nach der CA2 + -Behandlung (Abb. 5F, I und J). Um die potenzielle Rolle des BM bei der Regulation des epidermalen Keratinozytenverhaltens weiter zu bestimmen, wurde Typ-IV-Kollagen verwendet, um in vitro eine BM-ähnliche Struktur zu bilden. Die Behandlung mit Kollagen IV trug zur CK19-Expression bei und reduzierte die Expression von CK10 und CK14 auf mRNA- und Proteinebene in beiden HEKs (Abb. 7A-C und G) und die Hacatzellen (Fig. 7D-F und G). Diese Ergebnisse bestätigten unsere In-vivo-Befunde, dass das bmein positiver Regulator der Rekrutierung von präkursorähnlichen Zellen in der Basalschicht der Epidermis zu sein scheint.Veränderungen in der BM-Struktur förderten die Entwicklung eines aproliferativen Phänotyps in basalen Keratinozyten, wie durch die erhöhte Expression der mit der Zellproliferation assoziierten Marker, z. B. CK14 und CK5, angezeigt.

In der vorliegenden Studie untersuchten wir zunächst die morphologischen Veränderungen, die während der epidermalen Regeneration als Teil des Wundheilungsprozesses auftreten. Unsere Daten zeigten, dassdie histologische Struktur des hypertrophen Narbengewebes sich von der des normalen Hautgewebes unterschied, wobei eine signifikante Zunahme der epidermalen Dicke zwischen der Basalschicht und dem Stratum corneum beobachtet wurde. Bemerkenswerterweise schien die Färbung des BM abwesend zu seinim Narbengewebe. Darüber hinaus zeigte die Immunfluoreszenzfärbung für CK10, CK14, CK5, CK19 und Integrin-β1, dass sich die differentielle Expression von basalen Keratinozytenmarkern zwischen den Proben von normalem, Wundrand- und hypertrophen Narbengewebe unterschied, und außerdem zeigte die Epidermis des hypertrophen Narbengewebes einen proliferativen Phänotyp durch Umschalten der Expression von Integrin-β1 und CK19 auf CK14 und CK5, Marker der Zellproliferation, in der mehrschichtigen Epidermis. Angesichts dieser Ergebnisse stellten wir daher die Hypothese auf, dass das BM eine Rolle bei der Regulierung der spielt Zellschicksal Entscheidung von epidermalen Keratinozyten während der Wunde healing.By unter Verwendung eines Panels von Antikörpern, die mit BM-Komponenten assoziiert sind, haben wir unsere Hypothese bestätigt, dass die Struktur des BM in den hypertrophen Narbengeweben verändert wurde. Unsere Ergebnisse zeigten, dass das BMC zur Rekrutierung von CK19-exprimierenden Zellen in der basalen Schicht der normalen und Wundrandepidermis beitrug, wobei Abnormalitäten in der Struktur des BM die Basalkeratinozyten dazu veranlassten, sich während der Narbenpathogenese zu differenzieren und einen proliferativen Phänotyp anzunehmen. Durch die Verwendung von ECM und Collagen IV zur Nachahmung der BM-Struktur in vitro bestätigten wir unsere invivo-Beobachtungen weiter und zeigten, dass das BM die differenzierenden Reaktionen von Keratinozyten, die durch die Verabreichung von CA2 + in den epidermalen Zelllinien induziert wurden, reduzierte und die Expression von CK19, einem mutmaßlichen Marker für epidermale Genitorzellen, verstärkte.

Das BM spielt eine grundlegende Rolle bei der Differenzierung, Proliferation, Überleben und Migration von Zellen während der Embryonalentwicklung. In der Haut ist das BM physikalischtrennt die Epidermis von der darunter liegenden Dermis. Die Basalkeratinozyten in der Epidermis binden über Statine an das darunter liegende BM, die an einige BM-Komponenten wie Kollagen, Laminin und Fibronektin binden (25).Somit dient das BM nicht nur als selektive Barriere und strukturelles Gerüst, sondern bietet auch eine Kommunikationsschnittstelle zwischendermalen Fibroblasten und epidermalen Keratinozyten (2,26).Das BM bindet auch an eine Reihe von Zytokinen und Wachstumsfaktoren und dient als Reservoir für ihre kontrollierte Freisetzung, die die Keratinozyten-Fibroblasten-Wechselwirkungen reguliert, um die Entwicklung der Haut sowie die Wundheilung zu fördern (27,28). Frühere Studien zur Narbenbildung konzentrierten sich hauptsächlich auf Fibroblasten, und über die Rolle der darüber liegenden epidermalen Keratinozyten ist wenig bekannt (29,30). Es gibt zunehmend Hinweise darauf, Dasskeratinozyten durch parakrine Regulation der Fibroblastenfunktion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von pathologischer Fibrose spielen können (6,9,10).Es wurde auch gezeigt, dass sich Keratinozyten, die aus Narbengeweben stammen, von normalen Keratinozyten durch differentielle Genexpressionsprofile unterscheiden (12). Diemechanismen, die für die grundlegenden Anomalien Inkeratinozyten während Keloid und hypertrophe Narbenbildung bleibenelusiv. Unsere Daten zeigten eine mögliche Verbindung zwischen BM-Umbau und der Aufrechterhaltung der Keratinozytenfunktion während der Wundreparatur und Regeneration. Es ist bekannt, dass Adhäsionsmoleküle, wie Tannine und E- und N-Cadherin, Stammzellen an der ECM verankern (22). Im Lichte unserer Beobachtungen scheint es, dass das BM einen Teil der Hauptkomponenten für die Rekrutierung von epidermalen Vorläuferzellen in der Basalschicht der Hautepidermis darstellen kann. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dassdie abnormale Funktion des BM die Anhaftung von Basalprogenitorzellen an ihre umgebende Mikroumgebung verringert und sie dazu veranlasst, einen proliferativen Phänotyp anzunehmen, der für die Pathogenese der Narbenbildung verantwortlich sein kann (Abb.8).

Danksagungen

Diese Studie wurde teilweise durch Zuschüsse des Novel-Programms von Peking (Nr. 2008B53 und 2009A38) und der National Natural Science Foundation of China (Nr. 30901564,81101883, 81372067, 81121004 und 81230041) und der National BasicScience und Entwicklungsprogramm (973 Programm, 2012CB518105).

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